Abstrak
Gangguan usus dan kalsifikasi vaskular (VC) sering dikaitkan dengan penyakit ginjal kronis (CKD). Sementara perubahan penghalang usus telah dilaporkan pada CKD (seperti permeabilitas usus yang abnormal, pertumbuhan bakteri yang berlebihan, dan peradangan), tidak jelas apakah kalsifikasi vaskular memengaruhi perubahan ini. Untuk menyelidiki apakah hubungan dua arah antara VC dan disfungsi usus dapat dimediasi oleh peningkatan peradangan dan pembentukan toksin uremik, kami menggunakan model SNx-VC dari kalsifikasi vaskular uremik (tikus yang menjalani nefrektomi subtotal 5/6 dan diberi diet prokalsifikasi tinggi fosfat dan vitamin D). Kami mengonfirmasi keberadaan CKD dan VC dengan pewarnaan von Kossa dan mengamati peningkatan toksin uremik asal usus, indoksil sulfat (IS), pada hewan SNx-VC dibandingkan dengan kontrol. Pada tikus SNx-VC, kami mengamati penurunan produksi lendir (Alcian blue, pewarnaan Mucin 2) di usus besar dan ileum yang berkorelasi dengan tingkat kalsifikasi. Tidak ada perubahan pada penanda inflamasi atau ekspresi protein tight junction. Kami menilai kadar intestinal pada protein NOD-like receptor family pyrin domain containing 6 (NLRP6), yang diketahui mengatur sekresi mukus, dan tidak menemukan perubahan pada kolon atau ileum. Namun, mRNA Nlrp6 menurun pada kolon tikus SNx-VC, bersama dengan mRNA lainnya ( Ly96, Sod1 ), sementara Tlr2 meningkat dibandingkan dengan kontrol. Pengamatan kami terhadap mukus rendah, mRNA Nlrp6 rendah , dan IS tinggi pada tikus SNx-VC mengonfirmasi adanya hubungan antara perubahan barier usus dan VC uremik. Hal ini menunjukkan bahwa perubahan pada lapisan mukus dapat mendukung pembentukan toksin uremik asal usus dan meningkatkan VC pada CKD. Dengan demikian, peningkatan fungsi barier mukus usus dalam konteks VC uremik dapat dipertimbangkan sebagai strategi terapi yang memungkinkan pada pasien CKD.
Singkatan
Penyakit Ginjal Kronis (PGK)
penyakit ginjal kronis
ADALAH
indoksil sulfat
Bahasa Indonesia: NLRP6
Reseptor mirip NOD yang mengandung domain pirin 6
komputer
p -cresil sulfat
SNx
nefrektomi subtotal
VC
kalsifikasi vaskular
Penyakit ginjal kronis (CKD) adalah kondisi yang sering terjadi yang mempengaruhi lebih dari 10% dari populasi global [ [ 1 ] ]. Ketika CKD berkembang dan filtrasi glomerulus menurun, zat terlarut uremik terakumulasi dalam organisme [ [ 2 ] ]. Perubahan patofisiologis terjadi pada organ yang berbeda, dan perubahan sistem peredaran darah, metabolisme tulang, dan gangguan gastrointestinal diamati [ [ 3 ] ]. Secara khusus, pasien dengan CKD dapat menunjukkan kalsifikasi vaskular (VC) [ [ 4 ] ] yang menyebabkan gangguan elastisitas dan fungsi pembuluh darah (kekakuan arteri) dan kejadian kardiovaskular [ [ 5 ] ]. VC ditandai dengan pengendapan kristal fosfat dan kalsium (hidroksiapatit) di dinding arteri [ [ 6 ] ]. Usus, yang terlibat dalam asupan fosfat dan kalsium dari makanan dan metabolisme mineral, dapat memengaruhi patofisiologi VC uremik.
Mikrobiota usus adalah ekosistem kompleks mikroorganisme yang hidup di usus. Komunitas mikroba terbesar di dalam tubuh terdapat di usus besar, tempat interaksi imun dan metabolik yang intens antara host dan mikrobiota [ [ 7 ] ]. Hubungan simbiosis host-mikrobiota di usus besar dapat terganggu dalam konteks CKD dengan adanya perubahan saluran usus [ [ 8 ] ]. Pasien yang menjalani dialisis mungkin mengalami peristaltik usus yang abnormal dan transit usus yang melambat, yang dapat memicu pertumbuhan bakteri usus yang berlebihan [ [ 9 ] ]. Disbiosis mikrobiota usus juga diamati pada pasien CKD [ [ 10 ] ] dan banyak zat terlarut retensi uremik dapat berasal dari metabolisme mikroba usus besar [ [ 11 ] ]. Baru-baru ini, gabungan metagenomik mikrobioma dan metabolomik plasma mengungkapkan hubungan antara mikroba usus dan tingkat zat terlarut yang bersirkulasi yang dipengaruhi oleh CKD [ [ 12 ] ], seperti indoksil sulfat (IS) dan p -cresyl sulfat (PCS) [ [ 13 ] ], yang menunjukkan kemungkinan efek prokalsifikasi [ [ 14 ] ]. Namun, sedikit penelitian yang menilai hubungan antara CKD, VC, dan perubahan usus. Di sisi lain, menurut penelitian sebelumnya, ileum distal merupakan tempat yang menarik untuk pengamatan kerusakan usus dan sangat rentan terhadap permeabilitas usus, translokasi bakteri, apoptosis sel epitel [ [ 15 ] ], serta gangguan sambungan ketat [ [ 16 ] ].
Studi pada model hewan CKD menunjukkan bahwa jaringan usus juga mengalami perubahan [ [ 17 ] ]. Terlihat adanya penurunan ekspresi protein tight junction dan lapisan mukus yang lebih tipis pada permukaan bagian dalam usus selama CKD [ [ 18 ] ]. Peradangan usus pada model uremik juga ditunjukkan dengan peningkatan infiltrasi sel imun dan ekspresi sitokin pro-inflamasi [ [ 19 ] ]. Secara keseluruhan, hal ini menunjukkan adanya permeabilitas usus yang berlebihan pada CKD yang mendorong peradangan [ [ 19 , 20 ] ].
Perubahan metabolik dan fenotipik mikrobiota usus mungkin memengaruhi dinding usus melalui famili reseptor mirip NOD pyrin domain containing 6 (NLRP6). Kadar mRNA Nlrp6 dalam usus menurun pada pasien dengan obesitas dan diabetes tipe 2 dan pada tikus dengan obesitas yang disebabkan oleh diet [ [ 21 ] ]. Tetapi NLRP6 tampaknya juga penting untuk perlindungan ginjal, dan baru-baru ini, Valiño-Rivas et al . [ [ 22 ] ] menunjukkan hubungan antara penurunan ekspresi NLRP6 dan fibrosis di ginjal. Namun, belum ada penelitian yang dilakukan tentang peran NLRP6 di usus pada CKD atau CKD dengan VC. Sebagai sensor imun bawaan yang mengidentifikasi pola molekuler yang terkait dengan mikroba, NLRP6 memodulasi pelepasan sitokin dan ekspresi reseptor tol-like [ [ 23 ] ]. Selain itu, NLRP6 mengatur sekresi lendir, karena tikus N lrp6 −/− mengalami gangguan ketebalan lapisan lendir [ [ 24 ] ], dan juga dapat memengaruhi komposisi mikrobiota usus untuk melindungi epitel usus [ [ 25 ] ].
Dalam penelitian saat ini, kami menilai perubahan usus di ileum dan usus besar dengan teknik histologis dan molekuler dalam model kalsifikasi vaskular uremik dibandingkan dengan tikus uremik atau kontrol dan mengevaluasi kemungkinan keterlibatan NLRP6.
Metode
Model hewan
Semua percobaan pada hewan dilakukan menurut European Parliament Directive 2010/63/EU (No. CEEA-00322.03) dan disetujui oleh komite etik lokal untuk percobaan pada hewan Languedoc-Roussillon (CEEA-LR, no. 036, #18348). Pada usia 8 minggu, tikus Sprague–Dawley menjalani operasi semu (Kontrol) atau nefrektomi subtotal (SNx), di mana seluruh ginjal kanan dan 2/3 ginjal kontralateral diangkat (minggu ke-0). Setelah 8 minggu, sebagian tikus SNx diberi makan diet penginduksi VC yang diperkaya dengan fosfat (1,2% b/b makanan) dan vitamin D sebanyak 0,2 atau 0,8 μg/hari/kg berat badan yang diberikan secara oral 5 hari seminggu dalam bentuk pelet individual [ [ 26 ] ]. Dua belas minggu setelah pembedahan, hewan disuntik mati dengan suntikan mematikan pentobarbital (200 mg·kg −1 IV) dan bahan-bahan dikumpulkan. Darah dikumpulkan dalam tabung yang berisi heparin dan disentrifugasi selama 10 menit pada suhu 4 °C pada kecepatan 1500 g , setelah itu plasma disimpan pada suhu −80 °C. Jaringan (ginjal, aorta toraks, kolon, dan ileum) dikumpulkan dan diambil sampelnya untuk penentuan kalsium (jaringan segar), histologis (yang diawetkan dengan formalin), western blot (−80 °C), dan analisis qPCR (RNA protect dan −80 °C).
Biokimia dan HPLC plasma
Parameter biologis diukur dalam darah (kreatinin, urea, fosfat, kalsium) dan urin (kreatinin, protein) menggunakan penganalisa COBAS (Roche Diagnostics, Meylan, Prancis). Konsentrasi plasma indoksil sulfat (IS) dan p -cresil sulfat (PCS) diukur menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) dan spektrometri massa ionisasi elektrospray (ESI/MS) seperti yang dijelaskan sebelumnya [ [ 27 ] ]. Secara singkat, 200 μL sampel plasma dideproteinisasi dengan asam perklorat 70% dan disentrifugasi. pH supernatan disesuaikan menjadi 9 dengan kalium hidroksida 12 M dan dibekukan semalam pada suhu -20 °C. Keesokan harinya, sampel disentrifugasi lagi untuk mengumpulkan supernatan, dan pH disesuaikan menjadi 7. Sampel ditambah dengan 0,1% asam format hingga volume 250 μL dan difraksinasi dengan HPLC dengan 0,1% asam format sebagai fase A dan 100% etanol sebagai fase B. Lima belas fraksi per sampel diperoleh melalui gradien bertahap: Fraksi 1, 2, 3: EtOH 20%; Fraksi 4, 5: EtOH 40%; Fraksi 6, 7, 8: EtOH 60%; Fraksi 9, 10, 11: EtOH 80%; Fraksi 12, 13, 14, 15: EtOH 90–100%; yang dibekukan dengan cepat dan dikeringkan dalam kondisi beku-kering dalam pengering pelat vortex. Fraksi 4 dan 5, tempat IS dan PCS terdeteksi dalam percobaan percontohan, dilarutkan bersama dalam 10 μL asam format 0,1% dan dianalisis dengan ESI/MS. Konsentrasi IS dan PCS dihitung menggunakan kurva kalibrasi.
Kandungan kalsium
Sampel jaringan aorta segar didehidrasi pada suhu 110 °C dan didekalsifikasi dengan 100 μL HCl 0,6 m selama 24 jam. Kandungan kalsium diukur dalam supernatan HCl menggunakan metode komplekson O-kresolftalein sesuai dengan petunjuk yang diberikan oleh pemasok (ab102505; Abcam, Amsterdam, Belanda) dan dinormalisasi ke berat kering jaringan aorta.
Histologi
Potongan ginjal, aorta, kolon, dan ileum difiksasi dalam formalin dan ditanamkan dalam parafin. Potongan setebal lima mikrometer dipotong dan dipasang pada slide kaca, lalu dihilangkan parafinnya, dan diwarnai. Untuk semua pewarnaan, media pemasangan Entellan (Merck, Saint-Quentin-Fallavier, Prancis) dioleskan pada slide, yang kemudian ditutup dengan penutup kaca dan diperiksa serta difoto di bawah mikroskop cahaya (Nikon Eclipse TE300, Tokyo, Jepang).
Untuk mendeteksi fibrosis, potongan jaringan ginjal diwarnai dengan Sirius merah (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin-Fallavier, Prancis). Sinyal positif untuk kolagen terlihat dalam warna merah pekat. Fibrosis ginjal diukur dengan perangkat lunak imagej (US National Institutes of Health, Bethesda, MD, AS) pada 10 gambar korteks ginjal pada perbesaran 200 kali lipat.
Endapan kalsium pada potongan jaringan (aorta, kolon) dinilai menggunakan pewarnaan von Kossa, yang terdiri dari perlakuan dengan perak nitrat (Sigma-Aldrich) dan pewarnaan tandingan dengan Nuclear Fast Red (Sigma-Aldrich). Kuantifikasi endapan kalsium pada jaringan aorta dilakukan dengan perangkat lunak imagej pada gambar yang diambil dari tiga potongan aorta pada perbesaran 40 kali lipat.
Alcian blue digunakan untuk mendeteksi produksi lendir di jaringan ileum dan kolon. Kandungan lendir di ileum dan kolon juga terdapat pada 10 gambar jaringan usus total pada perbesaran 200 kali lipat. Hasil dinyatakan sebagai persentase dari area jaringan yang diwarnai, menggunakan imagej .
Hematoxylin/eosin digunakan untuk mendeteksi keberadaan sel imun di jaringan ileum dan kolon. Infiltrasi sel inflamasi di jaringan usus dinilai pada irisan yang diwarnai hematoxylin/eosin (10 gambar pada perbesaran 200 kali lipat) menggunakan skor yang ditetapkan oleh Erben et al . [ [ 28 ] ]. Infiltrasi sel imun minimal diberi skor 1 (< 10% dari total area mukosa), infiltrasi ringan diberi skor 2 (10–25%), infiltrasi sedang diberi skor 3 (25–50%), dan infiltrasi nyata diberi skor 4 (> 50%).
Pewarnaan imun
Sel positif CD68 dan kadar protein NLRP6 dan Mucin 2 di jaringan kolon dan ileum dideteksi melalui imunohistokimia (IHC) menggunakan antibodi anti-CD68 (MCA341R, 1 : 200; AbD serotec, Neuried, Jerman), anti-NLRP6 (ABF29, 1 : 1000; Millipore, Molsheim, Prancis), dan anti-mucin 2 (ab272692, 1 : 2000; Abcam). Setelah inkubasi semalaman, antibodi biotinilasi sekunder diaplikasikan, dan deteksi dilakukan dengan VECTASTAIN ® Elite ® ABC-HRP Kit (PK6200; Vector Laboratories, Newark, CA, AS) dan ImmPACT ® AEC (SK-4205; Vector Laboratories). Media pemasangan berair VectaMount™ AQ (Vector Laboratories) diletakkan pada slide sebelum ditutup dengan penutup kaca. Slide diperiksa dan difoto di bawah mikroskop cahaya (Nikon Eclipse TE300). Hasil dinyatakan sebagai persentase area jaringan yang diwarnai menggunakan imagej .
Western bercak
Jaringan kolon (100 mg) dari sampel yang dikriopreservasi dihomogenkan dengan FastPrep ® -24 (MP Biomedicals, Illkirch, Prancis) dalam buffer lisis RIPA (20-188; Millipore) dengan penambahan koktail penghambat protease/fosfatase (5872S; Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, AS). Konsentrasi protein diperkirakan dengan uji protein Pierce BCA (23225; Thermo Scientific™, Rockford, IL, AS). Protein (30 μg) dipisahkan pada gel SDS/poliakrilamida 10% dan dipindahkan ke membran Mini PVDF (1704156EDU; Bio-Rad, Hercules, CA, AS) dengan Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad). Setelah pemblokiran dalam susu 5%, inkubasi dengan antibodi pertama dilakukan semalam pada suhu 4 °C. Antibodi yang menargetkan β-aktin (sc-47778, 1 : 4000; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, AS), Occludin (91131S, 1 : 4000; Cell Signaling Technology), dan Claudin1 (ab15098, 1 : 1000; Abcam) digunakan sebagai antibodi pertama. Setelah inkubasi dengan antibodi sekunder yang sesuai yang dikaitkan dengan HRP (ab6789 dan ab6721; Abcam), substrat Immobilon Western HRP (WBKLS0100; Millipore) ditambahkan ke membran. Sinyal diperoleh dengan imager Vilbert Lourmat dan dikuantifikasi oleh perangkat lunak analisis imagej .
RTqPCR
Total RNA diisolasi dari 20 mg sampel jaringan kolon yang diawetkan dengan RNAprotect (76106; Qiagen, Hilden, Jerman) dengan RNeasy Mini Kit (74104; Qiagen) setelah dihomogenisasi dengan FastPrep ® -24 (MP Biomedical). Setelah pemurnian, RNA dielusi dengan 50 μL air bebas RNAse. Kualitas dan kuantitas RNA diperiksa dengan gel elektroforesis 1,6% dan instrumen NanoDrop™ One (Thermo Scientific™). cDNA untai pertama disintesis, dari 1 mg RNA, pada suhu 37 °C selama 60 menit dengan kit Transkripsi Balik Omniscript ® (205111; Qiagen). Primer spesifik yang tercantum dalam Gambar S1 dirancang dengan lightcycler Probe Design Software 2.0 (versi 1.0.R.36; Roche) dari sekuens mRNA yang ditemukan dalam basis data nukleotida NCBI dan divalidasi secara eksperimental. Primer disintesis oleh Integrated DNA Technologies (Leuven, Belgia). PCR kuantitatif dilakukan menggunakan 2,5 ng cDNA, 500 nm forward dan reverse primer, dan LightCycler 480 SYBR Green I Master kit (Roche) dalam LightCycler ® 96 Instrument (Roche). Ekspresi genetik diukur sebagai rasio ekspresi mRNA yang diinginkan yang dinormalisasi dengan ekspresi tiga gen referensi: Beta-actin (β-actin) , Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (Hprt1) , dan Ribosomal protein L32 (L32) .
Analisis statistik
Untuk variabel kontinu, kami menilai kenormalan dan melakukan transformasi logaritmik atau transformasi peringkat (untuk kandungan kalsium, fosfatemia, pewarnaan NLRP6 di kolon) untuk mencapai kenormalan. Uji statistik dilakukan pada variabel yang ditransformasikan, dan hasilnya disajikan dalam skala asli. Perbedaan rata-rata antar kelompok dianalisis dengan ANOVA diikuti oleh uji Tukey–Kramer untuk perbandingan berpasangan. Uji t satu sampel digunakan untuk membandingkan rata-rata kelompok dengan nilai tertentu. Untuk variabel kategoris, perbedaan antar kelompok diuji dengan uji eksak Fisher. Korelasi Pearson dilakukan antara variabel kuantitatif, dan nilai- P disesuaikan dengan tingkat penemuan palsu sebesar 5% menggunakan metode Benjamini–Hochberg. Semua pengujian mempertimbangkan kesalahan tipe 1 bilateral sebesar 5%. Semua data dilaporkan sebagai rata-rata ± SEM, kecuali dinyatakan lain.
Hasil
Karakteristik model
Menurut protokol, tikus dikelompokkan sebagai Kontrol (operasi semu), SNx, yang menjalani nefrektomi subtotal, dan SNx-VC, yang menjalani nefrektomi subtotal diikuti dengan diet tinggi fosfat dan vitamin D untuk menginduksi VC. Saat pengorbanan, kelompok SNx dan SNx-VC memiliki kadar kreatinin plasma yang lebih tinggi dan fibrosis ginjal dua kali lipat, yang menunjukkan fungsi dan integritas ginjal yang lebih rendah (Tabel 1 dan Gambar S1a ). Fosfat plasma, kalsium, dan produk Ca × P meningkat pada kelompok SNx-VC (Tabel 1 ). Kandungan kalsium dalam aorta toraks meningkat pada hewan SNx-VC dibandingkan dengan kelompok Kontrol dan SNx ( P < 0,05, Tabel 1 ). Kalsifikasi aorta diamati pada kelompok SNx-VC saja, pada 67% hewan (Tabel 1 ). Pewarnaan von Kossa positif pada irisan aorta adalah 10,2% ± 2,9 dari luas permukaan pada kelompok SNx-VC dan 15,3% ± 3,0 jika dibatasi pada hewan yang menunjukkan VC (Tabel 1 dan Gambar S1b ). Satu hewan dengan kalsifikasi aorta juga memperlihatkan pembuluh darah yang mengalami kalsifikasi di usus (Gambar S1c ).
Tabel 1. Penanda biokimia dan histologis CKD dan VC menurut kelompok.
Variabel yang ditransformasikan untuk analisis statistik
b Nilai- P < 0,05 dibandingkan dengan kontrol; c Nilai- P < 0,05 dibandingkan dengan SNx, dari uji post hoc Tukey setelah ANOVA.
Dibandingkan dengan Kontrol, IS meningkat pada SNx ( P < 0,05) dan SNx-VC ( P < 0,01) dengan cara yang sama (Tabel 1 , Gambar 1 ). Kadar PCS plasma lebih bervariasi, dan rata-rata kelompok tidak berbeda secara signifikan.
Gbr. 1
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Penentuan konsentrasi plasma toksin uremik yang berhubungan dengan usus pada berbagai kelompok tikus: kadar indoksil sulfat meningkat dalam plasma tikus SNx dengan atau tanpa VC, sedangkan kadar p -cresil sulfat tetap tidak berubah secara statistik. (A) Konsentrasi plasma IS dan (B) Konsentrasi plasma PCS yang diukur dengan ESI/MS. Data disajikan sebagai rerata ± SEM, dan setiap titik mewakili data dari seekor tikus. Nilai- P dari uji post hoc Tukey setelah ANOVA ditunjukkan: * P < 0,05; ** P < 0,01.
Perubahan jaringan di usus besar dan ileum
Pewarnaan hematoxylin/eosin pada usus menunjukkan akumulasi sel-sel kecil berwarna gelap di jaringan mukosa (Gbr. 2A ). Penilaian infiltrasi sel imun tidak menunjukkan perbedaan antar kelompok untuk ileum ( P = 0,8, Gbr. 2A,B ) dan meningkat pada SNx-VC di kolon ( P = 0,06, Gbr. 2A,B ). Sel-sel positif CD68 sebagian besar terletak di bagian luar lipatan mukosa, berbatasan dengan lumen usus (lihat panah pada Gbr. 2C ). Tidak ada perbedaan antar kelompok dalam persentase area yang diwarnai untuk CD68 di kolon atau ileum (Gbr. 2D ).
Gambar 2
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Jaringan kolon dan ileum tidak menunjukkan infiltrasi sel imun yang jelas pada tikus SNx dengan atau tanpa VC dibandingkan dengan kontrol. (A) Potongan kolon dan ileum yang diwarnai hematoxylin/eosin. Anak panah menunjukkan keberadaan akumulasi sel imun dan menyoroti infiltrasi seluler. Pembesaran asli ×200. (B) Skor infiltrasi sel imun diukur menggunakan pewarnaan hematoxylin/eosin menurut Erben et al . [ [ 28 ] ]. (C) Pewarnaan imun CD68 representatif pada potongan kolon dan ileum yang menunjukkan sel positif CD68 (anak panah). Pembesaran asli ×200. (D) Kuantifikasi sel positif CD68 (persentase jaringan yang diwarnai) dengan imunohistokimia (IHC). Pembesaran asli ×200. Data disajikan sebagai mean ± SEM, dan setiap titik mewakili data dari seekor tikus. Nilai- P < 0,1 dari uji post hoc Tukey setelah ANOVA ditunjukkan.
Kandungan mukus dievaluasi dengan pewarnaan biru Alcian dan imunopewarnaan Mucin 2. Pewarnaan positif ditemukan di sel goblet, tempat vesikel sekretori yang mengandung mukus hadir (Gbr. 3A,C ). Pewarnaan biru Alcian menunjukkan bahwa kandungan mukus menurun di kolon (-7,1% dari total area yang diwarnai, P = 0,017) dan ileum (-1,4%, P = 0,04) tikus SNx-VC dibandingkan dengan Kontrol (Gbr. 3B ). Ekspresi protein mucin 2 juga menurun di kolon ( P = 0,02) dan ileum ( P = 0,002) tikus SNx-VC (Gbr. 3D ). Selain itu, area positif CD68 berkorelasi terbalik dengan pewarnaan biru Alcian pada lendir ( r = −0,47) dan dengan protein Mucin 2 (IHC, r = −0,62) di usus besar (lihat Gambar S2 ).
Gambar 3
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Kandungan mukus dan tingkat Mucin 2 menurun pada tikus SNx dengan kalsifikasi vaskular dibandingkan dengan tikus kontrol pada jaringan kolon dan ileum. (A) Pewarnaan alcian biru representatif pada bagian kolon dan ileum. Pembesaran asli ×200. (B) Kuantifikasi kandungan mukus menggunakan pewarnaan alcian biru. (C) Pewarnaan imun Mucin 2 representatif pada bagian kolon dan ileum. Pembesaran asli ×200. (D) Tingkat protein Mucin 2 dengan IHC. Anak panah menunjukkan sel goblet. Data disajikan sebagai mean ± SEM, dan setiap titik mewakili data dari seekor tikus. Nilai- P dari uji post hoc Tukey setelah ANOVA ditunjukkan: * P < 0,05; ** P < 0,01.
Ekspresi gen di usus besar
Kami menyelidiki ekspresi mRNA gen yang terlibat dalam produksi mukus ( Mucin 2 ), imunitas dan inflamasi ( Il6 , Il10 , Il18 , N F κ B , Ccl2/Mcp1 , Tlr2, Tlr4, Ly96/MD-2, Aoah, Nlrp6 ), tight junction ( Cldn1, Cldn2, Cldn4, Ocln, Tjp1/ZO-1 ), dan aktivitas antioksidan ( Sod1, Cat ) di kolon (Tabel 2 , lihat Tabel S1 untuk arti singkatan). Tidak ada perubahan signifikan antar kelompok yang dideteksi oleh ANOVA. Namun, dengan menggunakan uji- t satu sampel , kami mengidentifikasi penurunan signifikan pada Nlrp6 , Ly96 , dan Sod1 pada SNx-VC dibandingkan dengan kelompok Kontrol (rata-rata 1 sebagai hipotesis nol), dan peningkatan ekspresi Tlr2 (Tabel 2 ). Kami juga menemukan peningkatan ekspresi Il18 pada tikus SNx dibandingkan dengan tikus Kontrol.
Tabel 2. Ekspresi mRNA relatif di kolon yang dinormalisasi dengan gen housekeeping ( β-actin/Hprt1/L32 ) dinyatakan sebagai rasio kelompok kontrol dan korelasi dengan mRNA Nlrp6 . Rata-rata relatif ± SEM.
Catatan : Nilai yang dicetak tebal dikaitkan dengan nilai P < 0,05.
korelasi Pearson P -nilai yang disesuaikan dengan tingkat penemuan palsu (FDR) sebesar 5% dengan metode Benjamini-Hochberg
b Nilai- P < 0,05 dari uji- t satu sampelvs. 1.
Kami mengamati korelasi positif antara ekspresi mRNA Nlrp6 dan mRNA Cldn2, Tjp1, Ocln, Sod1, Cat, Ly96 , dan N F κ B (semua nilai- P < 0,01, Tabel 2 , Gambar S2 ). Ekspresi mRNA Nlrp6 berkorelasi negatif dengan Tlr4 ( P < 0,05, Tabel 2 ).
Ekspresi protein
Kami menilai ekspresi protein NLRP6 di usus sebagai pengatur potensial produksi lendir, peradangan, dan integritas usus. Pewarnaan imun menunjukkan bahwa protein NLRP6 sebagian besar terletak di jaringan mukosa dan terkumpul di area perifer yang berdekatan dengan lumen usus dan kelenjar usus (Gbr. 4A ). Tidak ada perbedaan dalam pewarnaan imun NLRP6 antara kelompok di usus besar ( P = 0,23) atau ileum ( P = 0,62) (Gbr. 4B ).
Gambar 4
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Kadar protein NLRP6 tidak berubah akibat CKD di kolon dan ileum. (A) Gambaran representatif pewarnaan NLRP6 di kolon dan ileum. Anak panah menunjukkan jaringan mukosa. Pembesaran ×200. (B) Kadar protein NLRP6 berdasarkan IHC. Data disajikan sebagai rerata ± SEM, dan setiap titik mewakili data dari seekor tikus.
Kami menyelidiki ekspresi protein penghubung ketat Occludin dan Claudin-1 di kolon dengan western blot (Gbr. 5A,C ). Kadar protein yang diamati tidak berubah di antara kelompok dan tidak menunjukkan adanya gangguan penghalang epitel (Gbr. 5B,D ).
Gambar 5
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Kadar protein Occludin dan Claudin 1 tidak berubah dalam jaringan kolon tikus SNx dibandingkan dengan tikus kontrol. (A) Gambaran representatif ekspresi Occludin dan β-aktin dalam jaringan kolon dengan western blot. (B) Kuantifikasi ekspresi protein Occludin dengan western blot (dinyatakan sebagai rasio terhadap ekspresi β-aktin). (C) Gambaran representatif ekspresi Claudin1 dan β-aktin dalam jaringan kolon dengan western blot. (D) Kuantifikasi ekspresi protein Claudin1 dengan western blot (dinyatakan sebagai rasio terhadap ekspresi β-aktin). Data disajikan sebagai mean ± SEM, dan setiap titik mewakili data dari seekor tikus.
Korelasi antara penanda CKD, VC, dan perubahan usus
Kami mengeksplorasi korelasi menarik pada tikus uremik ( n =18, Tabel 3 ). Secara keseluruhan, fibrosis ginjal sangat berkorelasi dengan CKD (urea dan kreatinin plasma, r ≥ 0,8) dan fosfat ( r =0,78) dan secara signifikan, namun kurang penting, dengan VC (VC aorta, r =0,62). Itu berhubungan negatif dengan ekspresi mRNA Ocln , Il18 , dan Nlrp6 di kolon. Pola korelasi IS plasma sangat mirip dengan fibrosis ginjal (Tabel 3 ). Selain itu, korelasi negatif yang luar biasa diamati antara produksi mukus di kolon dan PCS yang bersirkulasi ( r =−0,56) (lihat Gambar S2 ).
Tabel 3. Peta panas korelasi terbatas pada hubungan signifikan dengan fibrosis ginjal, IS plasma dan/atau kandungan kalsium aorta pada tikus uremik (SNx dan SNx-VC).
Catatan : Huruf tebal menunjukkan koefisien korelasi Pearson dengan nilai P yang disesuaikan FDR < 0,05. Gradien warna menunjukkan nilai koefisien korelasi dari rendah (biru tua) hingga tinggi (merah tua).
Kadar kalsium aorta menunjukkan pola korelasi yang sedikit berbeda. Kadar ini berkorelasi erat dengan penanda VC lainnya (P, von Kossa) dan dengan kadar IS dan PCS plasma, tetapi tidak berkorelasi signifikan dengan urea dan kreatinin plasma ( r < 0,42). Menariknya, kadar kalsium aorta berkorelasi negatif dengan lendir kolon (pewarnaan biru Alcian), protein Mucin 2 ileum (pewarnaan imun), dan mRNA Sod1 (Tabel 3 ).
Peta panas korelasi untuk semua variabel tersedia dalam Gambar S2 . Pada tingkat mRNA di kolon, ekspresi Mucin 2 berkorelasi terbalik dengan Il6 ( r = −0,62) dan Il10 ( r = −0,59). Ekspresi Ccl2 berkorelasi kuat dengan kreatinin plasma ( r = 0,81) dan tingkat IS ( r = 0,55) (Gambar S2 ). Menariknya, ekspresi mRNA Nlrp6 di usus besar berkorelasi negatif dengan fibrosis ginjal ( r = −0,65) dan plasma IS ( r = −0,47) dan positif dengan ekspresi mRNA Ly96 ( r = 0,76), N F κ B ( r = 0,59), Claudin 2 ( r = 0,69), Tjp1 ( r = 0,66), Occludin ( r = 0,62), Catalase ( r = 0,68) dan Sod1 ( r = 0,49).
Diskusi
Studi saat ini difokuskan pada perubahan barier usus dalam model hewan pengerat VC uremik yang baru-baru ini ditetapkan. Temuan utama kami adalah penurunan produksi mukus di kolon dan ileum tikus yang mengalami kalsifikasi, yang berkorelasi dengan tingkat keparahan kalsifikasi. Perubahan lapisan mukus pada hewan-hewan ini dapat meningkatkan penyerapan prekursor toksin uremik yang berasal dari usus, seperti PCS dan IS. Memang, kadar PCS dan IS yang beredar berkorelasi negatif dengan produksi mukus kolon. Di kolon, ekspresi mRNA Mucin 2 berkorelasi terbalik dengan sitokin Il6 dan Il10 , yang menggambarkan kemungkinan konsekuensi disfungsi barier mukus untuk respons inflamasi. Selain itu, ekspresi mRNA Nlrp6 di kolon berkorelasi negatif dengan fibrosis ginjal dan IS yang beredar dan berkorelasi dengan gen yang terlibat dalam regulasi tight junction, inflamasi, dan stres oksidatif. Pada tingkat protein, NLRP6 tidak menurun di usus tikus CKD.
Kami mengembangkan model hewan pengerat yang diinduksi oleh pembedahan dan diet dari VC medial, sambil membatasi intervensi yang menegangkan seperti pemberian gavage oral atau suntikan intraperitoneal dan memberikan waktu yang cukup bagi CKD untuk berkembang sebelum menyebabkan kalsifikasi [ [ 26 ] ]. Tidak ada indikasi toksisitas yang diinduksi oleh diet yang parah (yaitu, keengganan terhadap pelet, mortalitas) dan dosis α-calcidol (0,2 atau 0,8 μg·kg −1 ) menghasilkan kadar VC yang serupa, tetapi insidensi meningkat dengan dosis yang lebih tinggi.
Penghalang mukus sangat penting untuk mencegah translokasi bakteri komensal dan patogen ke inang, dan mukus usus terutama terdiri dari Mucin 2 yang diproduksi oleh sel goblet [ [ 29 ] ]. Mukus juga menjaga mikrobiota usus yang sehat dengan menyediakan karbohidrat kompleks (yaitu, glikana) yang akan mendukung pertumbuhan bakteri tertentu [ [ 30 ] ]. Usus besar memiliki mukus dua lapis dengan lapisan dalam yang tidak dapat ditembus oleh bakteri [ [ 31 , 32 ] ]. Penetrasi bakteri dan kontaknya dengan epitel diamati pada model kolitis murine dan pasien dengan kolitis ulseratif [ [ 33 ] ]. Dalam penelitian ini, kami menilai kandungan mukus dalam sel goblet, dengan pewarnaan biru Alcian dan IHC yang ditargetkan Mucin 2. Pada tikus uremik yang mengalami kalsifikasi, penurunan produksi mukus diamati di ileum dan kolon serta korelasi negatif antara produksi mukus dan tingkat keparahan kalsifikasi vaskular. Oleh karena itu, hasil kami mendukung hasil dari Yan et al . [ [ 34 ] ] yang menggambarkan pengurangan jumlah sel goblet dan pewarnaan Mucin 2 di kolon tikus yang diberi vitamin D plus nikotin (VDN), model lain dari VC yang diinduksi vitamin D [ [ 35 , 36 ] ]. Penurunan produksi mukus juga sebelumnya diamati pada model tikus CKD [ [ 18 ] ] tetapi data pada pasien CKD belum dilaporkan [ [ 17 ] ]. Pada tingkat mRNA, korelasi negatif diamati dalam ekspresi Mucin 2 versus sitokin pro-inflamasi Il6 . Hal ini sejalan dengan ekspresi rendah lokal Mucin 2 yang terkait dengan ekspresi tinggi Il6 yang sebelumnya diamati pada kanker kolon [ [ 37 ] ].
Pada tikus SNx-VC yang mengalami kalsifikasi, keberadaan sel inflamasi meningkat di kolon. Infiltrasi makrofag kolon (CD68) tidak berbeda pada tikus CKD dibandingkan dengan Kontrol, sejalan dengan hasil Yang et al . [ [ 38 ] ], tetapi keberadaan makrofag berkorelasi terbalik dengan produksi mukus. Kami mengamati kadar IS yang tinggi dalam plasma tikus SNx dan SNx-VC, dan PCS plasma berkorelasi negatif dengan produksi mukus di kolon. Jadi, kami berhipotesis bahwa lapisan mukus yang lebih tipis pada tikus SNx-VC mendukung penyerapan metabolit asal usus. Memang, jika lapisan mukus kolon lebih tipis, bakteri lebih dekat ke epitel usus, dan paparan terhadap produk bakteri meningkat. Lebih jauh lagi, kekentalan lendir dan sifat fisikokimia (ukuran pori, viskoelastisitas, kekuatan ionik, pH, …) mempengaruhi permeabilitas terhadap molekul [ [ 39 , 40 ] ] yang dapat mempengaruhi penyerapan indole dan p -cresol dan akibatnya kadar IS plasma dan PCS [ [ 41 ] ]. Meskipun demikian, peningkatan kadar toksin uremik asal usus yang bersirkulasi pada tikus SNx juga merupakan konsekuensi dari penurunan fungsi ginjal. Memang, pada CKD mungkin sulit untuk menentukan apakah peningkatan kadar toksin uremik dalam darah terutama disebabkan oleh penurunan eliminasi oleh ginjal atau peningkatan produksi dan penyerapan usus [ [ 11 , 42 ] ]. Namun, diketahui bahwa konsentrasi IS serum berhubungan dengan keberadaan VC pada pasien CKD [ [ 43 ] ] dan pemberian IS pada tikus hipertensi menyebabkan kalsifikasi aorta [ [ 44 ] ]. Dalam penelitian ini, tingkat IS dan VC di aorta toraks berkorelasi, dan kita dapat berasumsi bahwa IS berpartisipasi dalam pembentukan VC pada tikus SNx-VC, seperti yang disarankan oleh penelitian sebelumnya [ [ 44 ] ].
Analisis ekspresi mRNA kolon menunjukkan bahwa sebagian besar gen yang ditargetkan tidak diekspresikan secara diferensial antara kelompok. Namun, perubahan dalam ekspresi mRNA yang terlibat dalam proses inflamasi diamati, seperti penurunan ekspresi Nlrp6 dan Ly96/MD-2 , koreseptor TLR4 untuk lipopolisakarida bakteri [ [ 45 , 46 ] ], serta peningkatan ekspresi Tlr2 , dalam kelompok SNx-VC. Lebih jauh lagi, sitokin pro-inflamasi Il18 [ [ 46 , 47 ] ] meningkat pada tikus uremik, secara signifikan dalam kelompok SNx. Pada tikus CKD yang mengalami kalsifikasi (kelompok SNx-VC), terdapat penurunan ekspresi mRNA Sod1 , tanda potensial stres oksidatif, yang mungkin telah memperkuat proses pro-inflamasi [ [ 48 ] ]. Meskipun demikian, ekspresi protein Claudin-1 dan Occludin yang dievaluasi dengan western blot di kolon tidak berubah, dan data kami tidak mendukung keberadaan gangguan tight junction dalam model.
Akhirnya, ekspresi mRNA Nlrp6 di kolon sangat berkorelasi dengan gen yang terlibat dalam tight junction ( Claudin-2, Tjp1/ZO-1, Occludin ), inflamasi ( Ly96/MD-2, NF κB ), dan regulasi stres oksidatif ( SOD1, Catalase ). Kadar mRNA Nlrp6 kolon juga berhubungan negatif dengan fibrosis ginjal (Sirius red) dan kadar IS plasma. Wlodarska et al . [ [ 24 ] ] menunjukkan bahwa inflammasome NLRP6 diekspresikan dalam sel goblet kolon tempat ia mengatur sekresi mukus, yang dikonfirmasi oleh Birchenough et al . [ [ 49 ] ]. NLRP6 baru-baru ini terbukti melindungi dari kerusakan usus pada pasien dan hewan pengerat dengan obesitas dan diabetes tipe 2 [ [ 21 ] ]. Meskipun demikian, tingkat protein dan ekspresi gen NLRP6 serupa antara kelompok-kelompok dalam penelitian ini, yang dapat disebabkan oleh kurangnya sensitivitas teknis atau sebagai alternatif peningkatan efikasi translasi protein atau stabilitas protein. Namun, ekspresi mRNA Nlrp6 yang berkurang dalam SNx-VC dikaitkan dengan penurunan ekspresi mRNA protein tight junction, inflamasi, dan antioksidan, yang menunjukkan bahwa Nlrp6 dapat menjadi pengatur penting adaptasi kolon dalam model ini. Peran NLRP6 dalam perubahan yang diamati di saluran gastrointestinal bagian bawah selama CKD dan VC masih memerlukan konfirmasi.
Keterbatasan utama dari penelitian kami adalah kami menemukan hasil antara pada kelompok SNx, yang dapat disebabkan oleh kurangnya daya atau tidak adanya efek pada hewan-hewan ini. Namun, kami mengidentifikasi perubahan signifikan pada kelompok SNX-VC, yang memiliki fibrosis ginjal serupa dibandingkan dengan SNx. Desain yang digunakan, dengan fosfat tinggi dan vitamin D dalam makanan, dapat secara langsung memengaruhi mikrobiota usus, yang tidak dievaluasi di sini. Keterbatasan lain dari penelitian ini adalah kami tidak menguji efek dari diet yang menginduksi VC pada hewan kontrol. Sementara kami tidak memperkirakan kalsifikasi vaskular terjadi tanpa adanya pengurangan massa ginjal, ini akan memungkinkan untuk menilai efek dari diet fosfat tinggi dan vitamin D pada jaringan usus. Namun, hasil dari Yan et al . [ [ 34 ] ] dalam model VC non-berbasis diet mengonfirmasi dan memperkuat pengamatan kami tentang hubungan antara lendir, IS, dan VC. Akhirnya, kami tidak mengevaluasi efek intervensi farmakologis atau nutrisi, yang akan membantu dalam menguraikan mekanisme yang terlibat dalam perkembangan CKD dan perubahan usus terkait VC. Secara khusus, asam lemak rantai pendek telah terbukti memengaruhi produksi lendir dan, baru-baru ini, kalsifikasi vaskular, menjadikannya kandidat yang menarik untuk menjelaskan modifikasi yang diamati pada VC terkait CKD [ [ 18 , 34 ] ].
Kesimpulan
Kami mengamati modifikasi signifikan dalam struktur dan fungsi usus yang terkait dengan model CKD dan kalsifikasi vaskular kami. Meskipun kami tidak dapat menyimpulkan sebab-akibatnya, hasil yang disajikan di sini menunjukkan bahwa peningkatan fungsi penghalang lendir usus dalam konteks VC uremik dapat dianggap sebagai strategi terapi yang memungkinkan untuk mencoba membatasi kadar toksin uremik asal usus, peradangan lokal, dan kalsifikasi pada pasien CKD.
