Abstrak
Karena agregasi protein—termasuk pemisahan fase cair-cair (LLPS) dan pembentukan fibril amiloid—memainkan peran penting dalam penyakit dan fungsi biologis, memahami mekanisme yang mendasari agregasi protein sangatlah penting. Protein rekombinan umumnya digunakan secara in vitro untuk menyelidiki proses agregasi protein. Namun, jika tag pemurnian tetap tidak terurai, hal itu dapat memengaruhi hasil dan menghalangi interpretasi yang akurat. Temuan kami menunjukkan bahwa tag His 6 -GFP dan His 12 secara signifikan memengaruhi pembentukan tetesan cairan dan fibril amiloid di wilayah yang tidak teratur secara intrinsik (IDR) dari protein pengikat elemen poliadenilasi sitoplasma tikus 3 (CPEB3) dan fragmen-fragmennya. Studi ini menunjukkan bahwa tag pemurnian secara signifikan memengaruhi uji agregasi, sehingga penting untuk memperhitungkan pengaruhnya untuk menafsirkan agregasi protein secara akurat.
Singkatan
CD , dikroisme sirkuler
CPEB3 , protein pengikat elemen poliadenilasi sitoplasma 3
DIC , interferensi kontras diferensial
DTT , ditiotreitol
Gu-HCl , guanidin hidroklorida
IDR , daerah yang secara intrinsik tidak teratur
IMAC , kromatografi afinitas logam terimobilisasi
IPTG , isopropil β- d -1-thiogalactopyranoside
LLPS , pemisahan fase cair-cair
TEM , mikroskop elektron transmisi
ThT , tioflavin T
WT , tipe liar
Dengan meningkatnya minat dalam biologi pemisahan fase, studi tentang agregat protein, termasuk tetesan cairan dan fibril amiloid, telah menerima perhatian yang meningkat dalam beberapa tahun terakhir [ [ 1 – 3 ] ]. Tetesan cairan memainkan peran penting dalam berbagai proses biologis, seperti transkripsi, organisasi kromatin, autofagi, dan transduksi sinyal [ [ 4 – 7 ] ], dengan mempromosikan kompartementalisasi dan menciptakan lingkungan reaksi khusus. Lebih jauh, pembentukan tetesan reversibel dapat bertransisi menjadi fibril amiloid padat dan ireversibel yang terlibat dalam penyakit neurodegeneratif [ [ 8 – 11 ] ]. Khususnya, studi terbaru telah menunjukkan bahwa fibril amiloid tertentu tidak hanya patogenik tetapi juga memainkan peran fisiologis penting [ [ 12 – 14 ] ]. Mengakui bahwa agregasi protein memainkan peran penting dalam proses patologis dan fisiologis, menjelaskan mekanisme yang mendasari pembentukannya tetap penting. Untuk mencapai hal ini, uji agregasi protein rekombinan telah digunakan secara luas sebagai pendekatan utama.
Dalam banyak penelitian, tag pemurnian dipertahankan selama analisis [ [ 15 – 18 ] ]. Tag His adalah salah satu tag yang paling umum digunakan karena berat molekulnya yang rendah dan kemudahan pemurnian melalui kromatografi afinitas logam terimobilisasi (IMAC), seperti Ni-NTA [ [ 19 ] ]. Namun, tag His terdiri dari serangkaian residu histidin, yang dapat mengubah distribusi muatan dan stabilitas termal protein [ [ 20 ] ]. Ini sangat penting untuk daerah yang tidak teratur secara intrinsik (IDR), di mana agregasi didorong oleh interaksi multivalen, termasuk interaksi elektrostatik, kation–π, π–π, dan dipol [ [ 21 – 24 ] ]. Akibatnya, keberadaan tag His dapat memiliki dampak yang nyata pada agregasi protein. Selain itu, karena p Ka histidin mendekati kisaran pH yang biasanya digunakan dalam kondisi eksperimental yang meniru pH fisiologis, keadaan muatannya cenderung memengaruhi perilaku agregasi.
Faktanya, penelitian sebelumnya telah melaporkan interpretasi ambigu dari perilaku agregasi protein yang mungkin disebabkan oleh pengaruh tag His pada protein dengan IDR [ [ 15 – 18 ] ]. Ketidakpastian ini menyoroti perlunya menilai ulang fenomena agregasi pada protein spesifik yang menarik secara biologis. Dalam konteks ini, protein pengikat elemen poliadenilasi sitoplasma 3 (CPEB3) muncul sebagai model yang menarik. CPEB3 adalah protein pengikat RNA yang penting untuk pembentukan memori jangka panjang [ [ 25 ] ]. Pada neuron, CPEB3 mengatur translasi sinaptik lokal dari subunit reseptor glutamat tipe AMPA dan aktin, sehingga mendukung proses fisiologis penting seperti plastisitas sinaptik dan pemeliharaan memori jangka panjang [ [ 25 , 26 ] ]. Pengaturan translasi CPEB3 diyakini dimodulasi oleh keadaan agregasinya, dengan penelitian sebelumnya menunjukkan kapasitasnya untuk membentuk tetesan dan fibril amiloid secara in vitro [ [ 14 , 15 , 17 , 18 ] ].
Dalam studi ini, kami menunjukkan bahwa perilaku agregasi IDR CPEB3 dan dua fragmen mirip prion yang terisolasi yang terkandung di dalamnya secara signifikan dipengaruhi oleh keberadaan tag His 6 -GFP atau tag His 12. Untuk memungkinkan penghilangan tag pemurnian yang efisien dari IDR yang rentan terhadap agregasi, kami mengembangkan protokol pembelahan tag dalam kondisi denaturasi ringan. Mengingat banyak protein mengandung IDR yang rentan terhadap agregasi, pengaruh tag pemurnian tidak terbatas pada CPEB3, yang menunjukkan potensi masalah umum dalam studi agregasi protein.
Bahan dan metode
Ekspresi dan pemurnian protein
Gen CPEB3 [1–459] tikus disubklon ke dalam vektor pET His 6 -GFP-TEV LIC (Addgene, Watertown, MA, AS). Varian GFP yang digunakan dalam konstruksi ini adalah superfolder GFP [ [ 27 ] ], yang direkayasa melalui beberapa mutasi untuk meningkatkan kecerahan, meningkatkan kelarutan, dan mencegah dimerisasi. Untuk analisis pembelahan protease, situs pembelahan HRV3C tambahan disisipkan di antara tag His 6 -GFP dan CPEB3 [1–459]. Akibatnya, konstruksi yang dihasilkan adalah His 6 -GFP-(situs pembelahan TEV)-(situs pembelahan HRV3C)-CPEB3 [1–459]. Gen CPEB3 [101–200] dan CPEB3 [294–410] tikus disubklon ke dalam vektor pET-28b menggunakan kloning In-Fusion. Selain itu, tag His 12 dan situs pembelahan TEV ditambahkan di terminal N. Gen α-synuclein manusia disubklon ke dalam vektor pET-15b. α-synuclein manusia dengan tag His 6 terminal N disubklon ke dalam vektor pET-ST-2.
Prosedur terperinci untuk ekspresi dan pemurnian protein disediakan dalam Informasi Pendukung; secara singkat, konstruksi CPEB3 dan α-synuclein diekspresikan dalam Escherichia coli BL21(DE3) yang dikultur dalam medium LB. α-Synuclein dimurnikan seperti yang dijelaskan sebelumnya [ [ 28 ] ]. Protein CPEB3 diekspresikan sebagai badan inklusi. Mereka dilarutkan dalam buffer Tris/HCl 50 mm ( pH 8,0) yang mengandung 8 M urea atau 6 M guanidine-HCl (Gu-HCl) dan dimurnikan menggunakan kolom HisTrap HP (Cytiva, Wilmington, DE, AS). Bagian dari protein yang dimurnikan sebelum pembelahan tag dipertahankan sebagai kontrol. Protein yang tersisa kemudian didialisis terhadap buffer yang sesuai. Protease His 6 -TEV kemudian ditambahkan, dan campuran diinkubasi semalaman pada 25 °C. Efisiensi pembelahan tag dievaluasi seperti yang dijelaskan di bawah ini dalam uji aktivitas protease. Tag dan protease yang terbelah dihilangkan dengan pemurnian kolom tambahan. Kemurnian protein dinilai dengan SDS/PAGE atau MALDI-TOF MS. Konsentrasi protein ditentukan dengan mengukur absorbansi pada 280 nm atau BCA Protein Assay Kit (Takara, Kusatsu, Shiga, Jepang).
Uji aktivitas protease
Untuk mengevaluasi aktivitas protease dalam kehadiran urea atau Gu-HCl, His 6 -GFP-CPEB3 yang dimurnikan [1–459] diencerkan menjadi 0,5 mg·mL −1 dalam 20 m m Tris/HCl (pH 8,0), 0,5 m m EDTA, dan 1 m m DTT, dan ditambah dengan 1–4 M urea atau 0,5–2 M Gu-HCl. Protease His 6 -TEV atau protease GST-HRV3C ditambahkan pada rasio protease terhadap substrat 1 : 50 (b/b), dan reaksi diinkubasi semalam pada suhu 25 °C. Protease TEV yang digunakan dalam penelitian ini mengandung mutasi yang meningkatkan stabilitas dan spesifisitasnya [ [ 29 – 34 ] ]. Efisiensi pembelahan proteolitik dievaluasi dengan SDS/PAGE.
Mikroskopi fluoresensi dan kontras interferensi diferensial
Untuk menginduksi agregasi protein, sampel protein 3 mm , awalnya dalam buffer fosfat 20 mm ( pH 7,4) yang mengandung 3 M Gu-HCl, diencerkan 60 kali lipat ke dalam buffer fosfat 10 mm (pH 7,4) yang mengandung 50 mm NaCl , menghasilkan konsentrasi protein akhir sebesar 50 μm . Untuk CPEB3 [1–459] (dengan atau tanpa tag His 6 -GFP), buffer pengenceran juga mencakup 1 mm DTT . Untuk CPEB3 [294–410] (dengan atau tanpa tag His 12 ), buffer pengenceran mencakup 10% PEG-8000 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, AS). Alikuot sampel sebanyak 4 μL ditempatkan ke dalam ruang sampel yang dirakit menggunakan selotip dua sisi dengan lubang yang telah dilubangi sebelumnya, dipasang pada slide kaca, dan disegel dengan penutup kaca. Pencitraan medan terang dan fluoresensi dilakukan menggunakan mikroskop confocal Axio Observer (Zeiss, Jena, Thuringia, Jerman) yang dilengkapi dengan lensa objektif kontras interferensi diferensial (DIC) Plan-Apochromat 63×/1.4. Untuk mikroskopi fluoresensi, fluoresensi GFP dieksitasi pada 488 nm
Uji kekeruhan
Larutan 2,5 m m CPEB3 [294–410] (dengan atau tanpa tag His 12 ), disiapkan dalam buffer fosfat 20 m m (pH 7,4) yang mengandung 3 M Gu-HCl, diencerkan 50 kali lipat ke dalam buffer fosfat 10 m m (pH 7,4) yang mengandung 50 m m NaCl dan 10% PEG-8000, menghasilkan konsentrasi protein akhir sebesar 50 μ m . Buffer pengenceran dipanaskan terlebih dahulu hingga 95 °C sebelum sampel dicampur. Sampel yang diencerkan selanjutnya diinkubasi pada suhu 95 °C selama 5 menit. Kekeruhan dipantau pada 600 nm menggunakan spektrometer UV–Vis V-750 (JASCO, Hachioji, Tokyo, Jepang) yang dilengkapi dengan pengubah sel Peltier berpendingin air PAC-743. Suhu kemudian diturunkan dari 95 hingga 4 °C dengan laju 1 °C·min −1 .
Uji fluoresensi tioflavin T
Larutan 3 m m CPEB3 [126–169] (dengan atau tanpa tag His 12 ) dan 3 m m α-synuclein (dengan atau tanpa tag His 6 ), disiapkan dalam buffer MES 50 m m (pH 5,5) yang mengandung 3 M Gu-HCl, diencerkan 60 kali lipat ke dalam buffer MES 50 m m (pH 5,5), menghasilkan konsentrasi protein akhir sebesar 50 μ m . Sampel diaduk terus-menerus pada suhu 37 °C selama 96 jam. Sekitar 5 μL sampel ditambahkan ke 1 mL buffer MES 50 m m (pH 5,5) yang mengandung 25 μ m ThT. Fluoresensi tioflavin T (ThT) direkam dari 440 hingga 550 nm menggunakan fluorometer FP-6500 (JASCO) dengan eksitasi pada 445 nm.
Pengukuran fluoresensi fenilalanin
Sampel CPEB3 [126–169] (dengan atau tanpa tag His 12 ), yang disiapkan seperti yang dijelaskan dalam uji fluoresensi ThT, diencerkan 10 kali lipat ke dalam buffer MES 50 mm ( pH 5,5). Fluoresensi fenilalanin direkam dari 250 hingga 450 nm menggunakan fluorometer FP-6500 (JASCO) dengan eksitasi pada 225 nm.
Pengukuran dikroisme sirkuler
Sampel CPEB3 [126–169] (dengan atau tanpa tag His 12 ) disiapkan seperti yang dijelaskan dalam uji fluoresensi ThT. Spektrum dikroisme sirkular (CD) direkam dari 199 hingga 250 nm menggunakan spektrometer dikroisme sirkular J-750 (JASCO) dengan sel kuarsa sepanjang lintasan 0,5 mm .
Mikroskop elektron transmisi
Agregat yang terbentuk dalam uji fluoresensi ThT dikumpulkan dengan sentrifugasi dan diencerkan lima kali lipat dengan air Milli-Q. Segera setelah pengenceran, sampel ditotolkan ke kisi karbon hidrofil dan diwarnai dengan EM-Stainer (Nisshin EM, Shinjuku, Tokyo, Jepang). Setelah dua kali pencucian dengan air Milli-Q, kisi diperiksa menggunakan mikroskop elektron transmisi JEM-1400 (JEOL, Akishima, Tokyo, Jepang).
Hasil dan Pembahasan
Persiapan CPEB3 yang tidak diberi tag dari badan inklusi
Kami mengembangkan protokol untuk memurnikan CPEB3 yang tidak ditandai dari badan inklusi dengan memisahkan tag pemurnian dalam kondisi denaturasi untuk mengevaluasi dampaknya pada agregasi (Gbr. 1A ). Kami membuat vektor yang mengkode His 6 -GFP-CPEB3 [1–459], His 12 -CPEB3 [126–169], dan His 12 -CPEB3 [294–410] (Gbr. 1B ) untuk pemurnian yang efisien menggunakan resin IMAC [ [ 35 , 36 ] ]. Di sini, CPEB3 [1–459] meliputi seluruh IDR dari CPEB3, sementara CPEB3 [126–169] dan CPEB3 [294–410] berhubungan dengan dua domain seperti prion [ [ 26 ] ]. Secara khusus, CPEB3 [126–169] kemungkinan membentuk fibril amiloid, sedangkan CPEB3 [294–410] terlibat dalam pembentukan tetesan [ [ 17 ] ]. Karena pemurnian CPEB3 dari fraksi yang larut terbukti menantang karena kecenderungan agregasi yang tinggi, kami memurnikan CPEB3 dari fraksi yang tidak larut. Setelah ekspresi bakteri, badan inklusi dilarutkan dengan 8 M urea atau 6 M Gu-HCl dan kemudian dimurnikan dengan kromatografi afinitas Ni-NTA
Gbr. 1
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Persiapan CPEB3 tanpa tanda. (A) Representasi skematis dari proses pemurnian dan penghilangan tanda untuk menyiapkan CPEB3 tanpa tanda. (B) Konstruksi CPEB3 yang digunakan dalam penelitian ini. (C) Aktivitas pembelahan tanda yang dimediasi protease dalam kondisi denaturasi. Protease TEV dan HRV3C dinilai untuk aktivitas pembelahan pada berbagai konsentrasi urea dan Gu-HCl menggunakan konstruksi His 6 -GFP-CPEB3 [1–459], yang mengandung situs pembelahan TEV dan HRV3C antara tanda His 6 -GFP dan CPEB3 [1–459]. Hasil representatif ditunjukkan.
Untuk mengoptimalkan kondisi pembelahan tag, kami menilai aktivitas protease TEV dan HRV3C menggunakan His 6 -GFP-CPEB3 [1–459], yang mengandung situs pembelahan TEV dan HRV3C. Kedua protease mempertahankan aktivitas dalam keberadaan konsentrasi denaturan yang rendah (Gbr. 1C ), konsisten dengan laporan sebelumnya [ [ 37 , 38 ] ]. Protease TEV tetap aktif hingga 4 M urea dan 1 M Gu-HCl, sementara protease HRV3C menunjukkan aktivitas pada 2 M urea dan 0,5 M Gu-HCl. Namun, di bawah kondisi 1 M urea, sampel tetap tidak terbelah setelah inkubasi semalaman, kemungkinan karena agregasi protein. Lebih jauh, protease HRV3C menyebabkan lebih banyak pembelahan nonspesifik daripada protease TEV. Ini mungkin karena kurangnya struktur yang ditentukan dalam CPEB3, yang membuatnya lebih rentan terhadap pembelahan nonspesifik. Berdasarkan hasil ini, kami memilih protease TEV untuk percobaan selanjutnya dan melakukan pembelahan tag dalam buffer reaksi TEV yang mengandung 2 M urea atau 1 M Gu-HCl. Tag yang terbelah dan protease TEV kemudian dihilangkan melalui pemurnian kolom tambahan.
Perhatikan bahwa penghilangan EDTA dari buffer reaksi TEV mengakibatkan berkurangnya efisiensi pembelahan dan pembentukan agregat yang terlihat (data tidak ditampilkan). Ini menunjukkan bahwa ion Ni 2+ yang bocor dari kolom Ni-NTA mendorong agregasi CPEB3. Agregasi tersebut dapat dimulai dengan koordinasi antara Ni 2+ dan tag His 6 , sebuah fenomena yang sebelumnya dilaporkan untuk protein bertag His lainnya [ [ 39 , 40 ] ]. Selain itu, penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa berbagai IDR dalam protein, seperti yang ada dalam α-synuclein, tau, dan TIA-1 [ [ 41 – 44 ] ], berinteraksi dengan ion logam melalui urutan asam amino yang kaya polar dan bermuatan negatif. Penelitian ini menunjukkan bahwa interaksi elektrostatik antara ion logam dan protein menyebabkan agregasi. Demikian pula, residu polar dan bermuatan negatif dalam CPEB3 dapat berkoordinasi dengan ion logam seperti Ni 2+ , terutama dengan adanya tag His 6 , yang selanjutnya mendorong agregasi. Oleh karena itu, sangat penting untuk menghilangkan ion Ni 2+ menggunakan EDTA.
Tag 6 -GFP miliknya menginduksi perubahan morfologi agregasi CPEB3 [1–459]
Untuk mengevaluasi dampak tag His 6 -GFP pada morfologi agregasi CPEB3 [1–459], kami menganalisis sifat agregasi CPEB3 [1–459], yang mewakili seluruh IDR CPEB3. Agregasi diinduksi dengan mengencerkan cepat His 6 -GFP-CPEB3 yang terdenaturasi [1–459] (dilarutkan dalam 3 M Gu-HCl) ke dalam buffer asli yang mengandung 10 m m fosfat (pH 7,4) dan 50 m m NaCl. Hasilnya, larutan CPEB3 [1–459] menjadi keruh secara merata, dan tetesan diamati dengan mikroskop DIC (Gbr. 2A ). Sebaliknya, ketika His 6 -GFP-CPEB3 [1–459] mengalami proses yang sama, ia tidak membentuk tetesan tetapi malah menghasilkan agregat amorf (Gbr. 2B ). Perilaku agregasi yang berubah dari His 6 -GFP-CPEB3 [1–459] kemungkinan besar disebabkan oleh interaksi antara tag His 6 -GFP dan CPEB3 [1–459], bukan dari kelarutan inheren tag His 6 -GFP [ [ 27 ] ] atau kesalahan pelipatan GFP. Perhatikan bahwa His 6 -GFP-CPEB3 [1–459] mempertahankan fluoresensi GFP-nya baik dalam Gu-HCl 3 M maupun dalam buffer asli, yang menunjukkan bahwa GFP tetap utuh secara struktural.
Gambar 2
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Efek tag His 6 -GFP pada morfologi agregasi CPEB3 [1–459]. (A) Larutan CPEB3 [1–459] dan gambar DIC dari agregatnya. (B) Larutan His 6 -GFP-CPEB3 [1–459] dan gambar DIC serta fluoresensi dari agregatnya. (C) Gambar DIC dan fluoresensi campuran CPEB3 [1–459] dan His 6 -GFP-CPEB3 [1–459]. (D) Gambar DIC dan fluoresensi campuran CPEB3 [1–459] dan His 6 -GFP. Skala batang adalah 20 μm. Gambar yang ditampilkan adalah contoh representatif.
Ketika His 6 -GFP-CPEB3 [1–459] ditambahkan ke CPEB3 [1–459] pada rasio molar 5%, droplet tersebut mengecil dalam ukuran dan menjadi teragregasi lebih rapat (Gbr. 2C ). Hal ini menunjukkan bahwa interaksi intermolekuler antara His 6 -GFP-CPEB3 [1–459] dan CPEB3 [1–459] mendorong pembentukan agregat kaku, dengan kontribusi dari tag His 6 -GFP dan daerah CPEB3 [1–459]. Khususnya, penambahan sejumlah ekuimolar tag His 6 -GFP yang diisolasi ke CPEB3 [1–459] secara signifikan mengubah morfologi agregat, mengubah droplet menjadi struktur amorf (Gbr. 2D ). Karena agregat amorf menunjukkan fluoresensi, tag His 6 -GFP dimasukkan ke dalam agregat CPEB3 [1–459] dan mengubah sifat agregasinya.
12 tag- nya menginduksi perubahan struktur fibril amiloid CPEB3 [126–169]
Karena CPEB3 [126–169] kemungkinan membentuk fibril amiloid [ [ 17 ] ], kami mengevaluasi efek tag His 12 pada pembentukan fibril dengan membandingkan fluoresensi ThT dari His 12 -CPEB3 [126–169] dengan fluoresensi sampel yang tidak ditandai. His 12 -CPEB3 [126–169] menunjukkan fluoresensi ThT yang ditingkatkan relatif terhadap sampel yang tidak ditandai (Gbr. 3A ), yang menunjukkan bahwa His 12 -CPEB3 [126–169] membentuk fibril yang lebih stabil daripada sampel yang tidak ditandai. Untuk mengonfirmasi bahwa fluoresensi ThT berasal dari fibril amiloid, kami mengukur spektrum CD CPEB3 [126–169] dengan dan tanpa tag His 12 (Gbr. 3B ). Hebatnya, His 12 -CPEB3 [126–169] menunjukkan puncak negatif yang jelas pada 206 dan 220 nm, yang menunjukkan karakteristik struktur heliks α dari fibril amiloid silang-α, dan tidak menunjukkan pembentukan lembaran-β yang terdeteksi, berbeda dengan fibril amiloid silang-β yang umum. Di sisi lain, CPEB3 yang tidak diberi tanda [126–169] menunjukkan puncak yang lebih lemah pada 233 nm, yang menunjukkan keberadaan struktur lembaran-β antiparalel minor dalam agregat yang terbentuk secara acak.
Gambar 3
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Efek tag His 12 pada struktur fibril amiloid CPEB3 [126–169]. (A) Uji fluoresensi ThT CPEB3 [126–169] dan His 12 -CPEB3 [126–169]. (B) Spektrum CD CPEB3 [126–169] dan His 12 -CPEB3 [126–169]. (C) Spektrum fluoresensi fenilalanin CPEB3 [126–169] dan His 12 -CPEB3 [126–169]. Pada His 12 -CPEB3 [126–169], fluoresensi tirosin dari situs pembelahan TEV juga diamati. Hasil yang disajikan merupakan gambaran dari percobaan yang berulang. Gambar TEM agregat (D) CPEB3 [126–169] dan (E) His 12 -CPEB3 [126–169]. Skala batang adalah 400 nm. Gambar yang ditampilkan merupakan contoh representatif.
Lebih jauh, kami mengukur fluoresensi fenilalanina dari agregat, karena CPEB3 [126–169] mengandung enam residu fenilalanina. Spektrum fluoresensi CPEB3 yang tidak diberi tag [126–169] menunjukkan pola khas fenilalanina bebas dalam larutan, sedangkan His 12 -CPEB3 [126–169] menunjukkan pergeseran merah (Gbr. 3C ), yang menunjukkan perbedaan konformasi yang mengubah lingkungan lokal residu fenilalanina. Kami juga memeriksa morfologi agregat sampel menggunakan mikroskop elektron transmisi (TEM; JEOL) dan mengungkapkan keberadaan fibril amiloid dalam His 12 -CPEB3 [126–169] (Gbr. 3D ), sedangkan sebagian besar agregat CPEB3 yang tidak diberi tag [126–169] muncul sebagai struktur amorf atau oligomer (Gbr. 3E ).
Hasil-hasil ini menunjukkan bahwa tag His 12 mendorong pembentukan fibril amiloid cross-α di CPEB3 [126–169]. Sampai saat ini, hanya sejumlah kecil fibril amiloid dengan struktur cross-α yang telah dilaporkan [ [ 45–47 ] ]. Khususnya, semua fibril amiloid yang dibentuk oleh homolog CPEB3 yang tidak memiliki tag pemurnian telah menunjukkan struktur cross-β-sheet [ [ 14 , 15 ] ]. Oleh karena itu , tag His 12 secara signifikan memengaruhi struktur fibril amiloid.
Mengingat bahwa CPEB3 [126–169] mengandung enam residu fenilalanina, empat residu histidina, dan tujuh residu glutamin, interaksi kation-π dan elektrostatik dapat memainkan peran penting dalam proses agregasi. Percobaan yang disebutkan di atas dilakukan pada pH 5,5, nilai di bawah p Ka histidina, yang menunjukkan bahwa residu His terprotonasi dan bahwa tag His 12 dapat memodulasi interaksi antarmolekul melalui efek yang dimediasi muatan. Secara keseluruhan, temuan ini menunjukkan bahwa tag His 12 mengubah struktur fibril CPEB3 [126–169] pada pH 5,5 melalui efek yang dimediasi muatan, yang lebih menyukai bentuk cross-α daripada cross-β.
12 tag- nya menginduksi perubahan keadaan agregasi CPEB3 [294–410] dari tetesan menjadi agregat amorf
Karena CPEB3 [294–410] terlibat dalam pembentukan droplet [ [ 17 ] ], kami mengevaluasi efek tag His 12 pada morfologi agregat dengan membandingkan citra DIC dari His 12 -CPEB3 [294–410] dengan citra sampel yang tidak diberi tag. Konsisten dengan pengamatan kami sebelumnya untuk CPEB3 [1–459] (tanpa adanya PEG-8000), tag His 12 juga mendorong pembentukan droplet untuk CPEB3 [294–410] dengan adanya 10% PEG-8000 (Gbr. 4A ). Sebaliknya, His 12 -CPEB3 [294–410] membentuk droplet yang mempertahankan fitur seperti droplet sambil beragregasi lebih luas, menghasilkan morfologi yang mengingatkan pada agregat amorf (Gbr. 4B ).
Gambar 4
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Efek tag His 12 pada LLPS CPEB3 [294–410]. Gambar DIC dari (A) CPEB3 [294–410] dan (B) His 12 -CPEB3 [294–410]. Skala batang adalah 20 μm. Gambar yang ditampilkan adalah contoh representatif. (C) Uji kekeruhan CPEB3 [294–410] dan His 12 -CPEB3 [294–410]. N = 3. Batang galat menunjukkan deviasi standar.
Kami juga melakukan uji kekeruhan untuk menentukan apakah tetesan terbentuk melalui LLPS, sebuah proses yang sering kali reversibel dengan perubahan suhu. Dalam uji ini, pengukuran dimulai pada 95 °C dan suhu secara bertahap diturunkan. Dalam kondisi ini, CPEB3 [294–410] menunjukkan kekeruhan rendah pada suhu tinggi, diikuti oleh peningkatan kekeruhan yang cepat setelah pendinginan (Gbr. 4C ). Sebaliknya, His 12 -CPEB3 [294–410] menunjukkan kekeruhan tinggi pada 95 °C dan hanya menunjukkan peningkatan kekeruhan yang sederhana saat suhu menurun. Setelah kekeruhan His 12 -CPEB3 [294–410] mulai meningkat tajam, profil kekeruhan berikutnya sangat cocok dengan CPEB3 yang tidak diberi tag [294–410].
Gambar DIC dan hasil kekeruhan menunjukkan bahwa agregat yang dibentuk oleh daerah CPEB3 [294–410] dalam His 12 -CPEB3 [294–410] serupa dengan agregat yang dibentuk oleh CPEB3 [294–410] saja, sementara tag His 12 tampaknya mendorong interaksi tambahan. Mengingat bahwa daerah CPEB3 [294–410] juga mengandung enam residu histidin, kemungkinan tag His 12 mengubah interaksi antarmolekul yang penting untuk LLPS dengan mendorong kontak yang dimediasi histidin secara berlebihan. Secara keseluruhan, temuan ini menunjukkan bahwa tag His 12 mengganggu LLPS yang khas, yang mengarah pada pembentukan agregat amorf.
Pembentukan fibril amiloid α-synuclein yang ditekan oleh 6 tag- nya
Untuk memeriksa apakah tag pemurnian juga memengaruhi agregasi protein lain, kami mengevaluasi efek tag His 6 pada pembentukan fibril α-sinuklein menggunakan pengukuran fluoresensi ThT. His 6 -α-sinuklein menunjukkan intensitas fluoresensi ThT yang lebih rendah daripada α-sinuklein WT (Gbr. 5A ). Lebih jauh, pencitraan TEM mengonfirmasi bahwa His 6 -α-sinuklein membentuk fibril amiloid yang mirip dengan yang dibentuk oleh α-sinuklein WT (Gbr. 5B,C ). Temuan ini menunjukkan bahwa tag His 6 sebagian menekan pembentukan fibril amiloid α-sinuklein.
Gambar 5
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Efek tag His 6 pada pembentukan fibril amiloid α-sinuklein. (A) Uji fluoresensi ThT dari α-sinuklein WT dan His 6 -α-sinuklein. Hasil yang disajikan merupakan gambaran dari percobaan yang berulang. Gambar TEM dari agregat (B) α-sinuklein WT dan (C) His 6 -α-sinuklein. Skala batang adalah 400 nm. Gambar yang ditampilkan merupakan contoh yang representatif.
Kesimpulan
Dalam studi ini, kami mengeksplorasi dampak dari tag pemurnian pada agregasi-diri CPEB3. Baik tag His 6 -GFP dan His 12 tampaknya meningkatkan sifat agregasi CPEB3, yang konsisten dengan studi sebelumnya yang melaporkan peningkatan pembentukan β-sheet, oligomerisasi, dan penurunan stabilitas termal [ [ 20 , 48 , 49 ] ]. Akibatnya, droplet CPEB3 menjadi amorf, dan oligomernya bertransisi menjadi fibril amiloid. Lebih jauh, tag His 6 menangkal efek peningkatan kelarutan dari tag GFP yang menyatu, sementara tag His 12 secara signifikan mengubah struktur fibril amiloid yang dihasilkan. Mengingat bahwa IDR dari CPEB3 mengandung sebanyak 14 residu histidin, masuk akal bahwa tag His memodulasi interaksi intra dan intermolekul melalui residu histidin ini. Memang, gugus histidin telah terbukti penting bagi pembentukan fibril dan droplet amiloid di Orb2 ( ortolog Drosophila ) dan CPEB4 [ [ 14 , 50 ] ]. Namun, mekanisme terperinci dari efek tag tersebut masih harus dijelaskan.
Karakterisasi agregat in vitro sangat penting untuk memahami pembentukannya in vivo dan kontribusi potensialnya terhadap fungsi dan penyakit. Namun, penelitian kami menyoroti perlunya menghilangkan pengaruh tag pemurnian selama karakterisasi agregat eksperimental. Tag His, yang banyak digunakan dalam produksi protein rekombinan karena kemudahan pemurniannya melalui kromatografi Ni-NTA [ [ 19 ] ], biasanya diasumsikan memiliki efek minimal pada struktur dan fungsi protein karena berat molekulnya yang kecil. Namun, kehati-hatian diperlukan saat menafsirkan eksperimen pada sifat agregasi dan karakteristik struktural CPEB3 yang dilakukan tanpa penghilangan tag His sebelumnya [ [ 15 – 18 ] ]. Lebih jauh lagi, efek tag pemurnian mungkin tidak dapat diabaikan dalam penelitian dengan protein lain yang terkait dengan LLPS atau pembentukan fibril amiloid, seperti ataxin-2, hnRNPA1, TDP-43, dan TIA-1 [ [ 51 – 55 ] ]. Ini mungkin juga mempengaruhi agregasi protein lain seperti α-synuclein, amyloid-β, huntingtin, dan protein prion [ [ 11 , 56 – 58 ] ]. Memang, kami menunjukkan bahwa tag His 6 sebagian menekan pembentukan fibril α-synuclein, sedangkan penelitian sebelumnya melaporkan bahwa itu mempromosikan pembentukan fibril amiloid-β [ [ 59 ] ]. Efek ini harus dipertimbangkan ketika membahas fungsi in vivo dan berbagai fenotipe penyakit yang terkait dengan polimorfisme amiloid dan LLPS.
Selain itu, skema pemurnian yang ditetapkan dalam studi ini, yang menggunakan protease TEV yang mempertahankan aktivitas kuat bahkan dalam kondisi denaturasi, dapat terbukti berharga untuk studi masa depan yang melibatkan IDR yang rentan terhadap agregasi seperti ataxin-2, hnRNPA1, TDP-43, dan TIA-1. Pembelahan tag selama proses pemurnian juga mengurangi agregasi, yang berpotensi menyederhanakan pemurnian protein. Faktor eksternal seperti asam nukleat, ion logam, ATP, dan fluktuasi pH diketahui berkontribusi terhadap agregasi [ [ 10 , 39 , 40 , 50 , 60 ] ], sehingga lebih baik untuk menghilangkan tag saat mempelajari hubungan antara faktor-faktor ini dan agregasi secara in vitro . Sebagai kesimpulan, studi kami memberikan bukti kuat tentang dampak signifikan yang dapat dimiliki tag pemurnian terhadap agregasi protein, yang menekankan perlunya pertimbangan cermat terhadap faktor ini dalam studi masa depan.
