Evaluasi dan modifikasi teknik isolasi sel tumor dari efusi ganas untuk pengujian sensitivitas obat secara cepat

Abstrak
Keputusan pengobatan kanker paru non-sel kecil bergantung pada beberapa langkah diagnostik. Uji yang bergantung pada pengurutan DNA sering kali gagal menangkap lanskap mutasi sel tumor secara penuh, dan pengujian kepekaan obat (DST) memiliki keterbatasan yang menghambat penggunaan secara luas saat ini. Salah satu tantangan utama untuk DST adalah isolasi cepat sejumlah sel tumor hidup yang cukup yang memungkinkan pengujian beberapa obat secara bersamaan. Untuk mengatasi tantangan ini, kami telah mengembangkan prosedur DST yang dirancang khusus untuk sel tumor yang berasal dari efusi pleura ganas. Kami pertama-tama mengidentifikasi sel tumor dengan molekul adhesi sel epitel (EpCAM) flow cytometry dan kemudian membandingkan beberapa metode untuk isolasi sel tumor: pengayaan imunomagnetik sel epitel menggunakan EpCAM, seleksi negatif melalui penipisan sel CD45 + imunomagnetik , dan pemisahan dan penangkapan sel tumor berdasarkan ukuran menggunakan penyaring sel. Dari metode-metode ini, putaran penipisan sel CD45 + yang berulang , di mana jumlah putaran ditentukan oleh persentase awal sel tumor dalam sampel, adalah yang paling efektif. Dengan menggabungkan pengayaan sel tumor dengan DST, kami telah mengembangkan sistem yang menghasilkan hasil DST yang berkorelasi dengan hasil klinis.

Singkatan
ALK
kinase limfoma anaplastik
BSA
albumin serum sapi
CT
tomografi terkomputasi
CTC
sel tumor yang bersirkulasi
DMSO
dimetil sulfoksida
Sistem Penyiaran Digital (DSS)
skor sensitivitas obat
Waktu Standar Waktu Standar (DST)
pengujian kepekaan obat
Asam EDTA
asam etilendiamintetraasetat
Bahasa Indonesia: EGFR
reseptor faktor pertumbuhan epidermal
Petugas medis
transisi epitel ke mesenkim
Bahasa Inggris: FAC
penyortiran sel yang diaktifkan oleh fluoresensi
FBS
serum sapi janin
FcR
Reseptor Fc
FFPE
jaringan tertanam parafin yang difiksasi dengan formalin
FSC dan SSC
hamburan maju-hamburan samping
DIA
hematoksilin dan eosin
Posyandu
imunohistokimia
MPE
efusi pleura ganas
Bahasa Indonesia: NGS
pengurutan generasi berikutnya
NSCLC
kanker paru non sel kecil
Bahasa Indonesia: PBS
garam penyangga fosfat
PCR
reaksi berantai polimerase
Bahasa Inggris
efusi pleura
PELIHARAAN
tomografi emisi positron
Sel darah merah
sel darah merah
RT
suhu ruangan
TKI
penghambat tirosin kinase
Angkatan Udara
frekuensi alel varian

1 Pendahuluan
Kemajuan dalam sequencing DNA telah memfasilitasi klasifikasi sekitar 30% pasien kanker paru non-sel kecil (NSCLC) berdasarkan perubahan genetik pemicu tumor tertentu [ [ 1 , 2 ] ]. Selama dua dekade terakhir, molekul kecil, terutama inhibitor tirosin kinase (TKI), yang menargetkan mutasi atau translokasi dalam ALK, ROS, NTRK, MET, EGFR, KRAS, dan BRAF telah disetujui secara klinis untuk pasien NSCLC, yang menghasilkan respons lengkap atau parsial dalam sebagian besar kasus [ [ 3 – 5 ] ].

Namun, sebagian besar pasien akhirnya menyerah pada perkembangan penyakit akibat resistensi pengobatan, yang disebabkan oleh mutasi titik pada domain kinase, amplifikasi gen kinase lainnya, dan aktivasi jalur kompensasi. Mekanisme resistensi ini dapat merespons TKI yang berbeda selain yang diindikasikan untuk mutasi primer [ [ 6 , 7 ] ].

Selain itu, pengujian genetika saat ini, yang digunakan untuk menentukan pengobatan yang ditargetkan bagi pasien kanker, hanya memberikan analisis parsial mengenai lanskap mutasi, terutama pada pasien kanker stadium lanjut [ [ 8 , 9 ] ]. Dengan demikian, penyaringan obat yang tidak bias yang mencakup semua terapi target yang tersedia diperlukan untuk mengidentifikasi pengobatan lini berikutnya yang terbaik bagi pasien ini dengan cepat.

Pemeriksaan obat, juga dikenal sebagai uji kepekaan obat (DST), menilai viabilitas sel tumor setelah terpapar berbagai obat untuk menentukan obat yang efektif mengurangi viabilitas/proliferasi sel tumor pada dosis terendah [ [ 5 , 10 ] ].

Meskipun penelitian bertahun-tahun dalam subbidang pengobatan yang dipersonalisasi ini, tidak ada uji DST yang saat ini diterjemahkan ke dalam manajemen klinis rutin pasien karena bukti klinis terbatas yang menghubungkan hasil DST dengan hasil terapeutik [ [ 11 ] ]. Kurangnya korelasi historis antara hasil DST dan hasil klinis mungkin sebagian berasal dari fakta bahwa DST sebelum munculnya terapi yang ditargetkan terutama dilakukan dengan kemoterapi, yang berdampak pada berbagai organ dan sel dalam tubuh yang tidak diulang secara in vitro . Namun, dengan munculnya terapi yang ditargetkan, yang berdampak minimal pada sel nontumor, hasil DST tumor in vitro dapat menunjukkan peningkatan korelasi dengan hasil klinis.

Keterbatasan lain dari pemeriksaan DST historis adalah waktu yang lama antara biopsi dan hasil pemeriksaan obat, karena banyak platform DST bergantung pada pembentukan organoid tumor atau garis sel kanker primer [ [ 5 , 12 ] ], yang dapat memakan waktu hingga 20 minggu, sedangkan pasien kanker stadium lanjut memerlukan perawatan segera.

Selain itu, dan bahkan sebelum memperoleh hasil DST, sel tumor dalam sampel harus segera diidentifikasi. Penilaian patologis biopsi padat dan sitologi cairan tubuh saat ini merupakan standar emas untuk diagnosis kanker; namun, hasil biasanya diterima tidak lebih awal dari 2–7 hari setelah pengambilan jaringan dan memerlukan penilaian oleh ahli patologi [ [ 13 ] ]. Untuk menetapkan DST cepat, yang bergantung pada keberadaan sel tumor segar dan hidup, proses identifikasi yang lebih cepat sangat penting.

Di sini, kami menyediakan metode praktis dan cepat untuk DST kanker, berdasarkan obat-obatan yang ditargetkan, yang dapat memberikan rekomendasi untuk perawatan kanker yang dipersonalisasi dalam 4 hari. Untuk tujuan ini, kami menggunakan efusi pleura ganas (MPE), yang terakumulasi pada lebih dari 20% pasien kanker paru-paru [ [ 14 , 15 ] ], sebagai sumber sel tumor. Untuk mengidentifikasi sel-sel tumor dengan cepat dalam MPE, kami menggunakan identifikasi flow cytometry dari molekul adhesi sel epitel (EpCAM), penanda sel tumor dalam MPE [ [ 16 , 17 ] ]. Selanjutnya, karena MPE bersifat heterogen dan sel-sel tumor hanya mewakili sebagian kecil dari total populasi sel MPE [ [ 18 ] ], isolasi sel tumor diperlukan sebelum menguji sensitivitas obatnya. Jadi, kami membandingkan beberapa metode isolasi sel tumor untuk merumuskan prosedur isolasi sel tumor yang efisien untuk memperkaya sel-sel tumor yang berasal dari MPE yang memadai untuk skrining obat.

2 Bahan dan Metode
2.1 Model eksperimen dan detail peserta studi
2.1.1 Pengumpulan efusi pleura dan pemurnian sel
Studi ini melibatkan partisipan manusia, sesuai dengan standar yang ditetapkan oleh Deklarasi Helsinki, dan telah disetujui oleh komite etik setempat, SMC-5494-18. Eksperimen dilakukan dengan pemahaman dan persetujuan tertulis dari masing-masing subjek.

Sampel cairan pleura dari 60 pasien dengan berbagai penyakit (Tabel S1 ) dikumpulkan di Chaim Sheba Medical Center selama September 2021 hingga Januari 2024. Untuk mencegah pembekuan dan penggumpalan, EDTA steril segera ditambahkan (konsentrasi akhir 10 mm ) . Sentrifugasi sampel (20 menit, 800  g ) memisahkan sel dari cairan. Selanjutnya, buffer lisis RBC (BioLegend, San Diego, CA, AS; 420301) digunakan untuk menghilangkan sel darah merah, diikuti dengan sentrifugasi lain (5 menit, 500  g ). Akhirnya, sel disaring melalui jaring 70-μm dan dibekukan dalam 90% FBS dan 10% DMSO.

2.1.2 Sampel efusi pleura—data klinis dan sitologi
Data dari pasien meliputi hal-hal berikut: usia saat evaluasi, jenis kelamin, riwayat tumor, pencitraan diagnostik (radiografi dada, tomografi terkomputerisasi, dan tomografi emisi positron), data sitopatologi dan/atau histopatologi. Analisis sitopatologi dilakukan dengan mikroskop konvensional, dan temuan dilaporkan menurut sistem internasional untuk pelaporan sitologi cairan serosa [ [ 19 ] ]. Semua sampel efusi pleura (PE) diperiksa menggunakan apusan. Imunohistokimia (IHC) blok sel hanya dilakukan untuk sampel dengan persentase sel ganas yang tinggi. MPE ditetapkan ketika sel tumor terdeteksi dalam efusi pleura melalui sitologi.

2.2 Rincian Metode
2.2.1 Imunohistokimia EpCAM
Sel-sel yang dimurnikan MPE dikumpulkan dalam tabung Eppendorf dan disentrifugasi pada 400  g selama 5 menit; pelet dicuci dengan PBS dingin dan difiksasi dengan 1 : 1 96% etanol: 4% paraformaldehida selama 5 menit. Pelet yang difiksasi disentrifugasi pada 1000  g selama 5 menit dan disuspensikan kembali dalam 5–20 μL gel Bio-Agar yang dicairkan (Bio-Optica, Milano, Italia). Gel yang berisi sel-sel diratakan menjadi cakram tipis, didinginkan pada ~ 0 °C, dilapisi pada kedua sisi dengan gel Bio-Agar yang dicairkan tambahan, didinginkan lagi, diikuti oleh pemrosesan FFPE rutin. Secara singkat, jaringan didehidrasi menggunakan serangkaian peningkatan konsentrasi alkohol (70%, 80%, 90%, 95%, dan 100%) dan kemudian penghilangan dehidran dengan xilena. Akhirnya, jaringan diinfiltrasi dengan parafin dan ditempatkan secara manual ke dalam blok. Jaringan yang tertanam dalam parafin dipotong menjadi irisan setebal 3,5 μm dan dipasang pada slide mikroskop. Slide ditempatkan dalam oven selama 1 jam pada suhu 60 °C sebelum melanjutkan ke langkah pewarnaan. Pewarnaan H&E dilakukan secara otomatis pada perangkat ST5020 (Leica Biosystems, Wetzlar, Jerman) sesuai dengan petunjuk pabrik pembuatnya. Pewarnaan imunohistokimia dilakukan dengan antibodi EpCAM (1 : 50, M0804, Dako, Glostrup, Denmark) pada modul pewarnaan Benchmark XT (Ventana Medical Systems., Oro Valley, AZ, AS) menggunakan iVIEW DAB Detection Kit (katalog #: 760-091, Ventana Medical Systems). Setelah imunopewarnaan, potongan-potongan tersebut diwarnai ulang dengan hematoksilin (Ventana Medical Systems), dibilas dalam air suling, dan akhirnya dikeringkan secara manual dalam etanol bertingkat (70%, 96%, dan 100%). Kemudian, potongan-potongan tersebut dibersihkan dalam xilena dan dipasang dengan Entellan (Surgipath, Eagle River, WI, AS). Gambar IHC diperoleh menggunakan mikroskop Olympus BX50 (Olympus Corporation, Tokyo, Jepang).

2.2.2 Aliran sitometri
Sel-sel yang dimurnikan dari efusi pleura disuspensikan dalam buffer FACS (EDTA 2 mm , BSA 1% dalam PBS) dan diblokir dengan reagen TruStain FcX™ (BioLegend, 422302). Selanjutnya, sel-sel diwarnai dengan antibodi terkonjugasi fluoresensi terhadap EpCAM (9C4, BioLegend, 324208) dan CD45 (HI30, BioLegend, 304008). Beberapa sampel sel diwarnai dengan antibodi terhadap EGFR (AY13, BioLegend, 352907), N-Cadherin (8C11, BioLegend, 350805), dan dengan reagen Helix NP™ (BioLegend, 425303) untuk mengevaluasi viabilitasnya. Peristiwa direkam menggunakan CytoFlex (Beckman Coulter, Brea, CA, AS) dan dianalisis menggunakan perangkat lunak flowjo (Ashland, OR, AS).

2.2.3 Pemisahan sel MPE berdasarkan ukuran sel
Sel efusi pleura disuspensikan dalam medium RPMI 1640 yang hangat. Sampel sel dengan jumlah yang sama disaring melalui filter pluriStrainer® dengan ukuran mata jaring 5, 10, atau 20 μm (PluriSelect, 43-50005-13, 43-50010-03, 43-50020-03). Kedua fraksi, sel yang melewati setiap saringan dan sel yang diambil dari saringan, dikumpulkan. Fraksi yang disaring dan sampel awal, sebelum disaring, dianalisis dengan flow cytometry untuk mengevaluasi sel EpCAM-positif.

2.2.4 Isolasi sel EpCAM +
Setelah lisis sel darah merah, 1 × 107 sel efusi pleura disuspensikan dalam medium RPMI 1640 biasa dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu RT dengan DNase (New England Biolabs, Ipswich, MA, AS; M0303S) pada konsentrasi 20 IU·mL −1 untuk mengurangi penggumpalan sel. Sel-sel tersebut kemudian disentrifugasi dan disuspensikan kembali dalam buffer Isolasi (PBS pH 7,2, 0,5% BSA, 2 m m EDTA). Isolasi sel positif EpCAM dilakukan menggunakan sistem pemisahan sel MACS (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Jerman) sesuai dengan petunjuk pabrik pembuatnya. Singkatnya, sel diblokir menggunakan reagen anti-FcR (Miltenyi Biotec, 130-059-901) dan kemudian diinkubasi pada suhu 4 °C dengan 100 μL CD326 MicroBeads (Miltenyi Biotec, 130-061-101) selama 30 menit. Setelah pencucian buffer isolasi dari manik-manik yang tidak terikat, sel berlabel magnetis kemudian dipisahkan dengan melewatkannya melalui kolom MS (Miltenyi Biotec, 130-042-201) yang dipasang pada magnet (Miltenyi Biotec, MiniMACS™ Separator 130-042-102, MACS® MultiStand 130-042-303). Akhirnya, kolom dilepaskan dari magnet dan sel berlabel dielusi ke dalam 3 mL buffer isolasi menggunakan pendorong.

2.2.5 Deplesi sel CD45 +
Setelah lisis sel darah merah, 1 × 107 sel efusi pleura disuspensikan dalam medium RPMI 1640 biasa dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu RT dengan DNase (New England Biolabs, M0303S) pada konsentrasi 20 IU·mL −1 untuk mengurangi penggumpalan sel. Sel-sel tersebut kemudian disentrifugasi dan disuspensikan kembali dalam buffer isolasi (PBS pH 7,2, 0,5% BSA, 2 m m EDTA). Deplesi sel positif CD45 dilakukan menggunakan MojoSort™ Human CD45 Nanobeads (BioLegend, 480029) dan MojoSort™ Magnet 5 mL (BioLegend, 480019) sesuai dengan petunjuk pabrik pembuatnya. Singkatnya, sel diinkubasi pada suhu 4 °C dengan 10 μL MojoSort™ human CD45 Nanobeads selama 15 menit. Setelah pencucian buffer isolasi dari manik-manik yang tidak terikat, sampel sel ditempatkan dalam magnet selama 6 menit. Sel yang diberi label dipertahankan pada magnet dan fraksi sel yang tidak berlabel dikumpulkan.

2.2.6 Analisis mutasi KRAS dan EGFR
Pelet sel beku cepat dari sel MPE (sel ‘Input’) dan sel CD45 − (sel tumor yang diperkaya) digunakan untuk mendeteksi mutasi KRAS dan frekuensi alel delesi EGFR. DNA diekstraksi menggunakan Grisp Genomic DNA Kit (GRISP REASERCH SOLUTIONS, Porto, Portugal; GK02.0100). Amplikon yang diinginkan diperkaya dalam PCR pertama menggunakan primer yang ditunjuk dengan ekor SP1/SP2 dan diberi label dengan kode batang sekuensing dalam PCR kedua. Semua sampel diurutkan menggunakan sequencer G400 dalam Teknologi 150PE DNBSEQ (MGI Tech Co., Shenzhen, Guangdong, Cina).

2.2.7 Obat-obatan
Obat-obatan berikut digunakan dalam penelitian ini: osimertinib (Selleck Chemicals, Houston, TX, AS; S7297), afatinib (Selleck Chemicals, S1011), alectinib (Selleck Chemicals, S2762), dan lorlatinib (Selleck Chemicals, S7536). Larutan stok disiapkan menggunakan DMSO, selanjutnya diencerkan dalam medium RPMI lengkap hingga mencapai konsentrasi yang sesuai, dan disemai dalam pelat 96-sumur. Obat-obatan disaring pada lima konsentrasi (0,03–3 μ m ) dengan kontrol pembawa konsentrasi DMSO yang sesuai.

2.2.8 Uji sensitivitas obat
Sel tumor yang dimurnikan dari MPE seperti dijelaskan di atas (subbagian 2.2.5 ) disemai pada kepadatan 1 × 104 sel per sumur pelat 96 sumur, dalam 100 μL medium kultur (RPMI yang dilengkapi dengan 10% FBS dan 1% larutan Pen-Strep). Sel-sel kemudian segera diobati dengan berbagai obat pada konsentrasi yang ditunjukkan, dan setelah 72 jam inkubasi (inkubator 37 °C, 5% CO2 ) , viabilitas sel diukur menggunakan kit proliferasi sel MTS (Abcam, Cambridge, Inggris; ab197010) sesuai dengan petunjuk pabrik. Secara singkat, 10 μL larutan tetrazolium MTS segar ditambahkan ke setiap sumur, dan sel-sel diinkubasi selama 3–6 jam dalam inkubator. Pengurangan senyawa MTS, yang berfungsi sebagai indikator viabilitas seluler, diukur menggunakan pembaca mikroplat TECAN Spark® pada panjang gelombang 490 nm.

2.3 Kuantifikasi dan analisis statistik
2.3.1 Analisis statistik
Analisis statistik dan semua grafik yang disajikan di sini, termasuk kurva dosis-respons, dibuat menggunakan graphpad prisma 8 (GraphPad Software Inc, Boston, MA, AS).

Uji Mann–Whitney dua sisi digunakan untuk membandingkan persentase median sel EpCAM + , yang ditentukan oleh flow cytometry, antara sampel pasien dengan hasil sitologi positif dan pasien dengan hasil negatif.

Tiga percobaan pengayaan dilakukan untuk membandingkan pemulihan sel dan pengayaan sel tumor antara metode yang dijelaskan.

Persentase pemulihan sel dihitung dengan persamaan berikut:

Pengayaan sel tumor dihitung dengan persamaan berikut:

Untuk menilai signifikansi statistik, uji ANOVA Welch atau uji ANOVA satu arah biasa digunakan.

Kurva dosis-respons DST diplot melalui jalur bioinformatika ‘Breeze’ [ [ 20 ] ]. Selanjutnya, parameter kurva dosis-respons digunakan untuk menghitung skor sensitivitas obat (DSS), seperti yang dijelaskan [ [ 21 ] ]. Akhirnya, signifikansi statistik DSS dievaluasi menggunakan uji- t tak berpasangan .

Untuk semua analisis statistik, hasil dianggap signifikan secara statistik jika nilai P < 0,05 diamati. Batang kesalahan menunjukkan kesalahan standar rata-rata. Rincian statistik dan jumlah sampel yang digunakan untuk hasil tertentu dapat ditemukan dalam keterangan gambar.

3 Hasil
3.1 Diagnosis MPE yang cepat dan sensitif menggunakan analisis FACS anti-EpCAM
Tujuan keseluruhan dari studi ini adalah untuk mengembangkan sistem yang kuat untuk DST yang dipersonalisasi dalam NSCLC dengan memanfaatkan MPE (Gbr. 1 ). Persyaratan pertama untuk proses ini adalah identifikasi cepat sel tumor dalam sampel. Identifikasi EpCAM dengan flow cytometry sebelumnya terbukti dapat membedakan antara MPE dan efusi sekunder akibat kondisi jinak [ [ 16 ] ]; tidak digunakan dalam praktik klinis saat ini. Di sini, kami memvalidasi metode ini, menguji total 60 efusi pleura yang dikeringkan dari 55 pasien kanker dan lima pasien yang mengalami kondisi jinak. Usia, jenis kelamin, diagnosis, dan hasil sitologi mereka dirangkum dalam Tabel 1 , dan daftar lengkap disediakan dalam Tabel S1 .

Gbr. 1
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Gambaran skematis alur kerja untuk pengobatan yang dipersonalisasi dengan memanfaatkan sel tumor dari efusi pleura ganas. Efusi pleura ganas (PE) dikeringkan, dan sel dikumpulkan dan diproses: sel dipeletkan, sel darah merah (RBC) dilisiskan, dan sel yang tersisa disaring untuk ekspresi molekul adhesi sel epitel (EpCAM). Hanya efusi yang mengandung sel EpCAM + yang terus mengalami pengayaan sel tumor. Setelah pengayaan sel tumor, sel kemudian diberikan obat yang ditargetkan pada konsentrasi yang berbeda ke dalam pelat 96 sumur dan dikultur selama 72 jam. Selanjutnya, uji viabilitas dilakukan untuk menentukan obat yang paling manjur untuk rekomendasi pengobatan. Seluruh proses, dari drainase MPE hingga rekomendasi pengobatan, selesai dalam waktu 96 jam. Akhirnya, hasil pengujian sensitivitas obat (DST) dibandingkan dengan hasil klinis. Gambar tersebut dibuat dengan Biorender.com .
Tabel 1. Karakteristik klinis pasien.

Memang, seperti yang ditunjukkan sebelumnya [ [ 16 ] ], ekspresi EpCAM terdeteksi hampir secara eksklusif di MPE (Tabel 1 ). Selain itu, hal itu sangat berkorelasi dengan hasil pemeriksaan sitologi positif (Gbr. 2 ), menunjukkan sensitivitas 100% dibandingkan dengan sitologi. Yang penting, EpCAM tidak diidentifikasi dalam sel yang dimurnikan dari efusi pleura pasien dengan kondisi jinak, maupun dari pasien kanker yang pemeriksaan sitologinya negatif untuk keganasan (Tabel S1 ).

Gambar 2
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Persentase sel EpCAM + berkorelasi dengan hasil sitologi klinis. Efusi pleura %sel EpCAM + ditentukan oleh analisis flow cytometry pada kelompok pemeriksaan sitologi negatif dan positif ( n  = 13 atau 47). Persentase median sel EpCAM + secara signifikan lebih tinggi pada sampel dengan hasil sitologi positif (** P  < 0,01, uji Mann–Whitney). EpCAM, molekul adhesi sel epitel.
Satu-satunya pengecualian adalah satu pasien yang memiliki sitologi negatif sementara memiliki 40% sel EpCAM + (Gbr. 2 , pasien 14 dalam Tabel S1 ). Pasien ini menderita NSCLC metastatik dan demensia dan tidak menerima perawatan onkologis khusus. Hasil sitologi sebelumnya positif, dan oleh karena itu, efusinya dianggap positif demi perhitungan spesifisitas. Dengan demikian, dapat disimpulkan bahwa flow cytometry EpCAM menunjukkan spesifisitas dan sensitivitas 100% untuk mendeteksi sel tumor epitel di MPE, jika dibandingkan dengan sitologi klinis.

3.2 Metode isolasi sel tumor secara langsung menghasilkan hasil sel tumor yang rendah
Meskipun analisis berbasis EpCAM FACS memungkinkan deteksi sel tumor secara cepat, analisis tersebut juga menunjukkan bahwa sel tumor biasanya hanya mewakili sebagian kecil sel MPE. Oleh karena itu, perlu dibuat metode untuk pengayaan sel tumor sebelum melakukan DST. Beberapa metode telah diuji dan dibandingkan dalam penelitian ini, dan dirangkum dalam Tabel 2 .

Tabel 2. Ringkasan metode pengayaan yang diuji.

Satu parameter yang sangat penting dalam sel tumor dalam MPE adalah bahwa diameter sel mereka lebih besar daripada jenis sel lain yang diidentifikasi dalam cairan, dan mereka sering membentuk gugus [ [ 22 ] ] (Gbr. 3A ). Memang, ketika melakukan penggerbangan 5% sel terbesar dari sampel MPE yang terdiri dari 28% sel EpCAM + (Gbr. 3B ), mayoritas sel yang digerbangi adalah EpCAM + (Gbr. 3C ).

Gambar 3
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Sebagian besar agregat sel dari efusi pleura ganas (MPE) adalah sel tumor. (A) Imunohistokimia representatif dari sel yang dimurnikan dari MPE yang diwarnai dengan antibodi anti-EpCAM. Skala batang, 200 μm. (B) Analisis sitometri aliran sel yang diisolasi dari MPE menunjukkan strategi penggerbangan dan histogram pewarnaan EpCAM. Panel atas representatif menunjukkan persentase sel tumor (EpCAM + ) dalam populasi sel total, sedangkan (C) panel bawah menunjukkan persentase sel tumor dalam 5% teratas populasi sel menurut ukuran. Semua gambar dan panel merupakan representasi dari tiga sampel MPE yang berbeda.
Selain itu, sebelumnya telah ditunjukkan bahwa sel tumor ovarium dari asites ganas dapat dimurnikan dengan melewatkan sel melalui filter jaring nilon dan mengumpulkan gumpalan sel besar yang masih terperangkap [ [ 23 ] ].

Oleh karena itu, untuk menggunakan metode yang serupa, serangkaian saringan sel dengan ukuran pori yang berbeda (5, 10, dan 20 μm) digunakan untuk menangkap sel tumor dari MPE. Ketika saringan dengan jaring 20-μm digunakan, laju pemulihan sel lebih rendah dibandingkan dengan jaring 10 dan terutama jaring 5-μm (Gbr. 4A ). Jelas, jaring 5-μm berhasil menangkap sel tumor dengan cara yang paling efisien, menghasilkan laju pemulihan sel rata-rata sebesar 34% (Gbr. 4A ). Namun, pengayaan sel tumor dua kali lipat diamati dengan semua ukuran pori (Gbr. 4B ).

Gambar 4
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Pengayaan sel tumor dengan manik-manik magnetik anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) dan penyaringan efusi pleura ganas (MPE) melalui saringan sel. Perbandingan efisiensi isolasi sel tumor (EpCAM + ) (% pemulihan sel) (A) dan pengayaan sel tumor (% perubahan lipatan EpCAM + ) (B), menggunakan manik-manik magnetik anti-EpCAM dan saringan berukuran pori 5-, 10- atau 20-μm. Persentase pemulihan sel dihitung dengan membagi jumlah sel EpCAM + hidup setelah pengayaan dengan jumlah awal sel EpCAM + hidup , dikalikan 100. Pengayaan sel tumor dihitung dengan membagi % sel EpCAM + setelah pengayaan dengan % sel EpCAM + awal . n  = 3. ** P  ≤ 0,01. Signifikansi statistik dievaluasi menggunakan uji ANOVA Welch. Batang galat menunjukkan galat baku.
Dengan demikian, meskipun pemisahan sel tumor MPE berdasarkan diameter merupakan pendekatan yang mudah dan cepat, namun hal tersebut tidaklah memadai karena gagal menghasilkan konsentrasi sel tumor yang cukup untuk DST berikutnya, terutama untuk MPE dengan persentase sel tumor yang rendah, karena hanya pengayaan dua kali lipat yang diamati.

Karena EpCAM merupakan penanda tumor yang sensitif dan spesifik dalam konteks MPE, kami selanjutnya menggunakan isolasi sel berbasis imunomagnetik sebagai metode pengayaan alternatif, memanfaatkan manik magnetik berlapis antibodi anti-EpCAM untuk menangkap dan mengisolasi sel tumor dari MPE.

Mirip dengan pemisahan berdasarkan ukuran, isolasi sel EpCAM + memperkaya sel tumor hanya rata-rata 2,5 kali lipat (Gbr. 4B ), dan tingkat pemulihannya juga rendah, rata-rata 14,5% (Gbr. 4A ), yang menyiratkan bahwa sejumlah besar sel EpCAM + awal hilang selama prosedur. Oleh karena itu, penggunaan manik magnetik EpCAM untuk seleksi positif juga terbukti tidak efisien untuk pengayaan sel tumor dari MPE.

3.3 Deplesi sel CD45 + secara efisien memperkaya sel tumor dari MPE
Karena kedua metode isolasi langsung terbukti tidak efektif, dengan pemulihan dan pengayaan sel tumor yang rendah, kami berhipotesis bahwa isolasi tidak langsung melalui penipisan sel nontumor dapat menghasilkan hasil sel tumor yang lebih tinggi.

Seperti yang disinggung di atas, sel tumor biasanya mewakili sebagian kecil dari total populasi sel MPE, yang mencakup berbagai jenis sel seperti leukosit dan sel mesothelial [ [ 18 , 24 , 25 ] ]. Jadi, kami menggunakan analisis flow cytometry, menggunakan antibodi yang menargetkan EpCAM (sel tumor [ [ 16 ] ]) dan CD45 (penanda pan-leukosit [ [ 26 ] ]) untuk membedakan antara sel tumor dan sel imun dalam sampel MPE. Analisis mengungkapkan bahwa kedua jenis sel ini merupakan populasi dominan dalam MPE, dengan tumpang tindih minimal yang dapat dideteksi di antara keduanya (Gbr. 5A ). Menariknya, populasi sel yang berbeda tidak memiliki ekspresi EpCAM dan CD45 (CD45 − / EpCAM − ), yang mencerminkan keberadaan jenis sel tambahan, seperti sel mesothelial, dalam MPE.

Gambar 5
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Deplesi sel CD45 + yang melimpah merupakan metode yang efisien untuk pengayaan tidak langsung sel tumor dari efusi pleura ganas (MPE). (A) Panel flow cytometry representatif yang menunjukkan pewarnaan CD45 dan molekul adhesi sel epitel (EpCAM) dari sel MPE, setelah lisis sel darah merah (RBC). (B) Grafik batang bertumpuk yang menunjukkan distribusi sel tumor dan sel imun dalam sampel MPE yang dikumpulkan dari pasien kanker. Perbandingan pengayaan sel tumor (C) dan (D) efisiensi isolasi sel tumor (EpCAM + ) (% pemulihan sel) antara dua metode berbasis manik imunomagnetik (pengayaan positif EpCAM, deplesi CD45) dan pemisahan ukuran sel menggunakan saringan 5-μm. Persentase pemulihan sel dihitung dengan membagi jumlah sel EpCAM + hidup setelah pengayaan dengan jumlah awal sel EpCAM + hidup , dikalikan 100. Pengayaan sel tumor (%EpCAM + perubahan lipatan) dihitung dengan membagi % sel EpCAM + setelah pengayaan dengan % sel EpCAM + awal . n  = 3, ** P  ≤ 0,01, * P  ≤ 0,05. Signifikansi statistik dievaluasi menggunakan ANOVA satu arah diikuti oleh uji Tukey. Batang kesalahan menunjukkan kesalahan standar.
Lebih jauh lagi, analisis sembilan sampel MPE yang dikumpulkan dari pasien kanker paru-paru menunjukkan pola distribusi selular yang konsisten. Sel imun mewakili populasi sel yang dominan, sementara sel tumor terdiri dari fraksi yang lebih kecil dari jumlah sel total (Gbr. 5B ), yang secara bersama-sama mencakup ~ 90% dari total populasi sel hidup. Populasi sel CD45 − /EpCAM − secara konsisten mewakili hingga 10% dari total populasi sel. Khususnya, dalam satu sampel (PEM52), yang dikumpulkan dari pasien kanker ovarium, mayoritas sel EpCAM + juga positif untuk CD45.

Mengingat banyaknya sel CD45 + dalam sampel MPE kanker paru-paru, penggunaan manik magnetik anti-CD45 dieksplorasi untuk menguras leukosit dari MPE, sehingga memperkaya populasi sel tumor yang tersisa.

Deplesi sel CD45 + menyebabkan pengayaan sel EpCAM + yang signifikan (Gbr. 5C ). Khususnya, lebih dari 50% sel tumor berhasil ditemukan kembali setelah deplesi, tingkat yang jauh lebih tinggi daripada yang diperoleh melalui seleksi positif EpCAM dan strategi pengayaan berdasarkan ukuran (Gbr. 5D ).

Secara keseluruhan, pemisahan sel tumor menggunakan penipisan sel CD45 + terbukti menjadi metode yang paling efisien dan efektif di antara yang diuji dalam penelitian ini.

3.4 Peningkatan pengayaan sel tumor melalui penipisan sel CD45 + berulang
Deplesi CD45 menggunakan manik magnetik anti-CD45 menghasilkan peningkatan signifikan dalam kemurnian sel tumor dalam sampel MPE, meningkatkan persentase sel tumor hingga ~ 10 kali lipat. Namun, populasi sel nontumor dan nonleukosit (CD45 − /EpCAM − ) yang cukup besar diidentifikasi setelah deplesi (Gbr. 6A ), yang menunjukkan perlunya pengoptimalan lebih lanjut untuk mencapai isolasi sel tumor yang optimal.

Gbr. 6
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Pemisahan magnetik berulang CD45 secara signifikan meningkatkan pengayaan sel tumor dari efusi pleura ganas (MPE). (A) Panel flow cytometry representatif yang menunjukkan pengayaan sel tumor (EpCAM + /CD45 − ) setelah satu putaran deplesi CD45. (B) Histogram flow cytometry CD45 representatif yang menunjukkan pengurangan signifikan MFI (intensitas fluoresensi median) sel MPE setelah inkubasi dengan manik magnetik anti-CD45 (‘Manik terkonjugasi’ versus ‘Tidak terkonjugasi’). (C) Histogram flow cytometry EpCAM representatif (panel atas) dari pemisahan magnetik berulang yang menggunakan manik magnetik berlapis antibodi anti-CD45 dan plot titik hamburan sisi depan (FSC-SSC) (panel bawah) dari populasi sel yang sama. Titik merah mewakili sel EpCAM + , dan kepala panah menunjuk ke area populasi sel yang terdeplesi. (D) Strategi gating representatif dan histogram flow cytometry EpCAM dari sel input dan sel CD45 − (dua putaran pemisahan magnetik menggunakan manik magnetik berlapis antibodi anti-CD45), diikuti oleh histogram EGFR dan N-Cadherin yang diperoleh dari populasi EpCAM + yang digated. (E) Pengurutan generasi berikutnya yang ditargetkan dari mutasi KRAS atau penghapusan EGFR dilakukan pada sel input MPE dan sel CD45 − (dua putaran pemisahan magnetik menggunakan manik magnetik berlapis antibodi anti-CD45) dari dua pasien. Peta panas yang mewakili persentase sel tumor dan frekuensi alel varian (VAF). Semua panel mewakili tiga sampel MPE yang berbeda. EpCAM, molekul adhesi sel epitel.
Identitas populasi sel CD45 − /EpCAM − yang diamati setelah penipisan CD45 dapat berupa salah satu sel berikut: sel mesothelial, trombosit, dan berpotensi sel CD45 + yang tidak terdeteksi oleh antibodi anti-CD45, mungkin karena ekspresi C45 yang rendah. Menariknya, penambahan manik magnetik berlapis anti-CD45 ke sampel MPE, tanpa pemisahan magnetik berikutnya, menyebabkan pengurangan populasi sel CD45 + yang tampak menurut analisis FACS (Gbr. 6B ). Temuan ini menunjukkan bahwa manik magnetik dapat secara sterik memblokir pengikatan antibodi anti-CD45 ke epitop targetnya, yang mengakibatkan perkiraan yang lebih rendah dari jumlah sel CD45 + . Dengan demikian, populasi sel CD45 − /EpCAM − dapat terdiri dari leukosit yang terikat pada manik magnetik. Oleh karena itu, putaran pemisahan magnetik tambahan mungkin diperlukan untuk meningkatkan efisiensi penipisan CD45 dan pengayaan sel tumor. Memang, peningkatan signifikan dalam persentase sel tumor EpCAM + diamati setelah tiga putaran penipisan (Gbr. 6C ). Lebih jauh, peningkatan jumlah sel EpCAM + yang relatif besar (sel berlabel merah di panel bawah Gbr. 6C ) berkorelasi dengan pengurangan jumlah populasi sel yang relatif lebih kecil (kepala panah, Gbr. 6C ), yang menunjukkan keberhasilan penghilangan subset sel imun melalui pemisahan magnetik berulang.

Khususnya, tidak seperti manik-manik CD45, penambahan manik-manik magnetik berlapis anti-EpCAM ke sampel MPE, tanpa pemisahan magnetik berikutnya, tidak menyebabkan pengurangan populasi sel EpCAM + yang tampak menurut analisis FACS (Gbr. S1 ), yang menyiratkan bahwa blok sterik oleh manik-manik magnetik bergantung pada klon antibodi spesifik yang digunakan untuk analisis.

Selain itu, untuk memverifikasi bahwa heterogenitas tumor tidak diubah oleh pengayaan, kami menilai ekspresi dua penanda seluler, EGFR dan N-Cadherin [ [ 27 , 28 ] ], dalam sampel MPE asli dan membandingkannya dengan sampel yang diperkaya sel tumor setelah dua putaran penipisan sel CD45 + . Memang, sementara ada peningkatan yang signifikan dalam persentase sel EpCAM + setelah penipisan, pola ekspresi penanda tidak berubah (Gbr. 6D ). Lebih jauh lagi, analisis sequencing generasi berikutnya (NGS) yang ditargetkan dari dua sampel MPE, satu mengandung mutasi KRAS G12A dan yang kedua mengandung penghapusan EGFR ekson 19 Glu746-Ala750, mengungkapkan peningkatan frekuensi alel yang bermutasi setelah penipisan sel CD45 + , berkorelasi dengan pengayaan sel tumor EpCAM + (Gbr. 6E ). Temuan ini memvalidasi bahwa penipisan CD45 + yang berulang memperkaya sel tumor yang mewakili populasi sel tumor asli dan dapat meningkatkan persentase sel tumor hingga ~50% atau lebih, sehingga memungkinkan evaluasi sensitivitas obat dilakukan pada sebagian besar sel tumor.

3,5 DST sel tumor yang diperkaya dari MPE dapat memprediksi respons klinis
Setelah menetapkan prosedur pengayaan sel tumor yang efisien, kami bertujuan untuk menilai validitas prediktif hasil DST saat menggunakan deplesi CD45 + sebelum DST. Hal ini dicapai dengan menguji respons sel tumor, yang diisolasi dari sampel MPE pasien NSCLC yang digerakkan EGFR yang belum pernah menjalani pengobatan, terhadap pengobatan yang ditargetkan dan diikuti oleh korelasi dengan perubahan genetik dan hasil klinis. Sampel tersebut mengalami deplesi sel CD45 + dan sel tumor yang diisolasi (sel CD45− ) diobati dengan panel obat yang ditargetkan pada berbagai konsentrasi selama 72 jam, diikuti oleh penilaian viabilitas sel menggunakan uji MTS untuk menentukan kemanjuran obat. Untuk menilai dampak obat pada sel imun kontrol, populasi sel CD45 + (sel imun) menjalani pengujian yang sama dan dibandingkan dengan populasi sel CD45− ( sel tumor). Memang, DST mengungkapkan sensitivitas yang ditingkatkan secara signifikan terhadap terapi yang ditargetkan dalam populasi sel CD45- dibandingkan dengan populasi CD45 + (DSS > 10, Gambar 7A,B ). Temuan ini menekankan pentingnya mengisolasi sel tumor dengan penipisan CD45 + dari sampel MPE heterogen untuk evaluasi efikasi obat yang akurat. Selain itu, respons obat diferensial diamati dalam populasi sel CD45- , dengan sensitivitas yang lebih besar terhadap inhibitor EGFR (osimertinib, afatinib) dibandingkan dengan inhibitor ALK (alectinib, lorlatinib) (DSS > 10, Gambar 7A,B ). Memang, sejalan dengan hasil DST, respons parsial klinis diamati setelah 3 bulan pengobatan dengan osimertinib (Gambar 7C ). Temuan ini menekankan potensi penggunaan sel tumor yang diperkaya dari sampel MPE untuk DST guna memandu keputusan pengobatan yang dipersonalisasi pada NSCLC.

Gbr. 7
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Pengujian kepekaan obat pada sel efusi pleura ganas (MPE) CD45 − memprediksi respons terapeutik yang sesuai dengan genotipe. (A) Kurva dosis-respons osimertinib, afatinib, alectinib, dan lorlatinib pada sel CD45 + dan CD45 − , yang diisolasi dari kanker paru non-sel kecil MPE yang dipicu reseptor faktor pertumbuhan epidermal (EGFR). n  = 4, ** P  ≤ 0,01 untuk osimertinib dan afatinib saat membandingkan sel CD45 − dengan sel CD45 + . Signifikansi statistik dievaluasi menggunakan uji- t tak berpasangan . Batang galat menunjukkan galat baku. (B) Skor sensitivitas obat (DSS) dihitung untuk (A), membandingkan antara sel CD45 + dan CD45− dan antara obat yang menargetkan EGFR (osimertinib dan afatinib) dan anaplastic lymphoma kinase (ALK) (alectinib dan lorlatinib), ** P  ≤ 0,01. Signifikansi statistik dievaluasi menggunakan uji- t tak berpasangan . Batang galat menunjukkan galat baku. (C) Pemindaian tomografi terkomputasi (CT) dan tomografi emisi positron (PET-CT) dari pasien yang sama sebelum dan setelah 3 bulan pengobatan osimertinib. Efusi pleura dan dua nodul di paru kanan menghilang.
4 Diskusi
Kanker paru-paru tetap menjadi penyebab utama kematian terkait kanker, dengan NSCLC mewakili subkelompok terbesar. Sementara terapi yang ditargetkan telah meningkatkan hasil bagi pasien dengan mutasi pemicu tertentu, munculnya mekanisme resistensi memerlukan pendekatan yang lebih komprehensif terhadap pemilihan pengobatan. Lebih jauh, pola mutasi NSCLC yang terus berkembang dan keterbatasan pengujian genetik saat ini menekankan perlunya platform penyaringan obat yang tidak bias untuk mengidentifikasi strategi terapi yang optimal bagi individu.

Pengujian kepekaan obat merupakan alat yang menjanjikan untuk pengobatan yang dipersonalisasi pada NSCLC, tetapi penerapannya dalam panduan pengobatan terhambat oleh beberapa faktor penting. Waktu penyelesaian yang lama terkait dengan metode yang memerlukan pembentukan organoid tumor atau garis sel murni [ [ 5 , 12 ] ] dan potensi perubahan fenotipik dan genetik sel tumor selama kultur yang diperpanjang membatasi kegunaan klinisnya [ [ 29 , 30 ] ]. Selain itu, pertumbuhan berlebih sel nontumor di lingkungan mikro tumor dapat mengaburkan respons sel tumor terhadap obat [ [ 10 , 31 ] ].

Untuk mengatasi keterbatasan ini, kami berfokus pada pengembangan metode cepat dan efisien untuk mengisolasi sel tumor dari MPE untuk DST lebih lanjut, karena MPE dapat berfungsi sebagai sumber yang kaya untuk sel tumor.

Pertama dan terutama, metode yang andal untuk mengidentifikasi sel tumor dalam MPE sangatlah penting. Kami menggunakan ekspresi EpCAM sebagai biomarker untuk mengidentifikasi sel tumor dalam MPE menggunakan flow cytometry. Hasil kami menunjukkan sensitivitas dan spesifisitas EpCAM yang tinggi untuk mendeteksi sel tumor, yang mendukung integrasinya sebagai alat diagnostik yang berharga.

Mengingat persentase median sel tumor yang rendah dalam MPE, kami mengevaluasi strategi untuk memperkaya sel tumor guna memastikan bahwa hasil DST berikutnya terutama mencerminkan respons sel tumor.

Sementara beberapa kelompok penelitian telah memanfaatkan pengayaan sel tumor berbasis EpCAM dari efusi ganas untuk DST [ [ 10 ] ], dan yang lain telah menggunakan deplesi sel CD45 + untuk memperkaya sel tumor sebelum pengurutan DNA [ [ 32 ] ], tidak ada penelitian yang membandingkan metode isolasi sel tumor yang berbeda dari efusi ganas untuk mencapai pemulihan sel tumor dan pengayaan sel tumor yang optimal. Hal ini sangat penting untuk DST di mana sejumlah besar sel tumor hidup diperlukan untuk menguji sensitivitasnya secara bersamaan terhadap ratusan obat dan kombinasi obat secara paralel pada sampel yang sama.

Metode pertama yang diuji mengeksploitasi perbedaan ukuran yang jelas antara sel nontumor dan sel tumor dalam MPE, yang cenderung lebih besar dan sering membentuk klaster [ [ 22 , 33 , 34 ] ]. Dengan memanfaatkan filter dengan ukuran pori yang berbeda untuk secara selektif mempertahankan sel tumor yang lebih besar, filter 5-μm menunjukkan tingkat pemulihan sel tertinggi. Namun, pengayaan keseluruhan sel tumor EpCAM + tetap suboptimal. Ini mungkin karena filter 5-μm mempertahankan sel tumor dan nontumor, sehingga menghasilkan faktor pengayaan sel tumor yang rendah mirip dengan filter dengan ukuran pori yang lebih besar. Temuan ini menunjukkan bahwa sementara filtrasi berbasis ukuran dapat berkontribusi pada pengayaan sel tumor, strategi tambahan diperlukan untuk mencapai tingkat kemurnian yang diinginkan, khususnya dalam MPE dengan beban sel tumor yang rendah.

Selanjutnya, pengayaan sel tumor dinilai dengan teknik di mana populasi sel tertentu diisolasi menggunakan manik-manik magnetik berlapis antibodi. Mengingat sensitivitas dan spesifisitas identifikasi sel tumor berbasis EpCAM, strategi awal difokuskan pada seleksi positif berbasis EpCAM. Namun, tingkat pemulihan yang rendah dan pengayaan suboptimal yang dicapai menggunakan metode ini memerlukan pendekatan alternatif.

MPE dicirikan oleh komposisi seluler heterogen, yang utamanya terdiri dari sel imun (CD45 + ) dan sel tumor (EpCAM + ). Yang penting, kami telah menemukan tumpang tindih minimal antara pewarnaan CD45 dan EpCAM dalam sampel kanker paru-paru. Jadi, untuk menghindari keterbatasan pengayaan berbasis EpCAM, strategi penipisan CD45 dievaluasi. Dengan menargetkan ekspresi CD45 yang ada di mana-mana pada leukosit, pendekatan ini memungkinkan pengayaan sel tumor yang signifikan, menunjukkan kemanjuran yang lebih unggul dibandingkan dengan seleksi berbasis EpCAM saja. Yang penting, beberapa putaran penipisan CD45 selanjutnya meningkatkan kemurnian sel tumor dan mengurangi populasi sel nontumor. Sementara sel CD45 + mewakili populasi sel utama dalam MPE, sekitar 10–20% sel MPE adalah sel CD45 − /EpCAM − , yang mungkin mewakili sel mesothelial. Penipisan sel mesothelial menghadirkan tantangan karena kurangnya penanda permukaan spesifik. Namun, kelimpahan populasi sel nontumor CD45− yang relatif rendah menunjukkan bahwa strategi penipisan CD45 saja mungkin cukup untuk mencapai populasi yang diperkaya sel tumor di sebagian besar sampel.

Menariknya, beberapa kelompok telah membandingkan teknik isolasi sel tumor untuk sel tumor yang bersirkulasi (CTC) dari darah. Saini et al menunjukkan bahwa Parsortix® PR1 (pengayaan berbasis ukuran dan deformabilitas) optimal untuk pengayaan CTC [ [ 35 ] ], sementara Drucker et al. menunjukkan bahwa metode ScreenCell® (pengayaan berbasis ukuran) optimal [ [ 36 ] ]. Dibandingkan dengan data yang disajikan di sini, penelitian ini menunjukkan metode isolasi sel tumor berbasis ukuran sebagai yang optimal, sementara kami menemukan deplesi sel CD45 + sebagai yang optimal. Perbedaan ini mungkin terkait dengan konsentrasi sel yang berbeda dalam efusi ganas dibandingkan dengan sampel darah, karena sel tumor jarang dalam darah (1–1000 dalam tabung darah standar 5-mL) [ [ 35 ] ], sementara sel CD45 + berlimpah. Dengan demikian, deplesi CD45 mungkin tidak praktis untuk sampel darah di mana rasio sel tumor/CD45 + adalah ~ 1 : 10 6 . Sebaliknya, sejumlah besar sel tumor, termasuk agregat sel tumor, dalam MPE dapat menyumbat pori-pori filter yang digunakan untuk isolasi sel tumor, sehingga mengurangi efisiensi metode berbasis ukuran untuk MPE. Demikian pula, efisiensi isolasi sel tumor rendah yang ditemukan di sini untuk pengayaan imunomagnetik sel tumor menggunakan EpCAM (sistem pemisahan sel MACS, Miltenyi Biotec) mungkin merupakan hasil dari agregat sel tumor yang menyumbat kolom MACS yang digunakan dengan teknologi ini.

Akhirnya, untuk mengevaluasi keakuratan prediktif DST dalam memandu keputusan terapeutik bagi pasien kanker paru, sel tumor diisolasi dari pasien NSCLC mutan EGFR yang belum pernah menjalani pengobatan menggunakan metode pengayaan deplesi sel CD45 + yang dioptimalkan . Sel tumor yang diisolasi tersebut dikenakan serangkaian terapi yang ditargetkan, yang menunjukkan profil sensitivitas diferensial. Khususnya, populasi sel tumor CD45− menunjukkan sensitivitas yang lebih tinggi terhadap inhibitor EGFR dibandingkan dengan populasi sel imun CD45 + , yang menyoroti pentingnya mengisolasi populasi sel tumor murni untuk penilaian respons obat yang akurat. Yang terpenting, sensitivitas in vitro yang diamati terhadap osimertinib berkorelasi dengan respons klinis.

Keberhasilan penerapan DST pada pasien NSCLC mutan EGFR yang belum pernah menjalani pengobatan menekankan potensi pemanfaatan DST yang dikombinasikan dengan teknik isolasi sel canggih dalam memandu strategi pengobatan yang dipersonalisasi bagi pasien NSCLC.

Meskipun penelitian ini memberikan dasar untuk mengembangkan platform DST yang kuat, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengeksplorasi penerapannya di berbagai kasus di mana penargetan EpCAM untuk identifikasi sel tumor mungkin tidak sesuai.

Pertama, meskipun EpCAM ditemukan sebagai penanda yang dapat diandalkan untuk sel tumor dalam darah, asites ganas, dan MPE, ada kasus di mana ia gagal mengidentifikasi sel tumor. Heterogenitas tumor atau perubahan fenotipe seluler, seperti transisi epitel-ke-mesenkimal (EMT), dapat mengurangi ekspresi EpCAM atau menghambat deteksinya [ [ 22 , 37 ] ]. Lebih jauh lagi, ekspresi EpCAM terbatas pada keganasan langka dengan asal seluler yang berbeda, termasuk sarkoma dan mesothelioma [ [ 38 ] ]. Akibatnya, sementara EpCAM memenuhi persyaratan spesifisitas dan kecepatan metodologi kami, strategi diagnostik alternatif diperlukan untuk kasus-kasus spesifik ini. Memang, beberapa penelitian telah mengeksplorasi kegunaan penanda, seperti CEA, CDH1, dan MGB1 untuk identifikasi CTC dalam darah pasien kanker [ [ 27 , 39 ] ]. Selain itu, de Wit et al. mampu mengidentifikasi adanya CTC dalam populasi sel EpCAM − menggunakan antibodi Pan-Cytokeratin [ [ 40 ] ]. Demikian pula pada MPE, penanda seperti CYFRA 21-1, CEA, dan NSE telah terbukti efektif untuk mendeteksi sel tumor [ [ 41 , 42 ] ].

Pendekatan proteomik juga digunakan untuk mengkarakterisasi dan menemukan penanda permukaan alternatif untuk sel tumor di MPE [ [ 43 , 44 ] ].

Terakhir, pengurutan generasi berikutnya (NGS) yang ditargetkan dapat berkontribusi pada karakterisasi mutasi penggerak sel tumor di MPE [ [ 45 ] ] dan, seperti yang ditunjukkan oleh penelitian kami, dapat menguatkan identifikasi sel tumor setelah pengayaan.

Keterbatasan kedua dari penelitian ini muncul dalam kasus-kasus di mana melakukan deplesi sel CD45 + berulang tidak berkontribusi pada pengayaan dan integritas sel tumor. Kami mengidentifikasi satu kasus MPE, yang berasal dari pasien kanker ovarium, di mana sebagian besar sel EpCAM + diwarnai bersama untuk CD45. Ada beberapa indikasi dalam literatur populasi sel EpCAM + /CD45 + . Telah ditunjukkan bahwa dalam sampel cairan asites pasien kanker ovarium, terutama dalam sampel pascakemoterapi, mayoritas sel tumor adalah sel CD45 + /EpCAM + yang berasal dari lokasi tumor primer EpCAM + . Sel-sel ini menunjukkan resistensi tinggi terhadap terapi dan peningkatan invasi dibandingkan dengan populasi sel CD45− / EpCAM + [ [ 38 ] ].

Kehadiran sel CD45 + / EpCAM + juga dilaporkan dalam jaringan tumor padat, MPE, dan darah pasien dengan NSCLC [ [ 46 ] ]. Sel-sel positif ganda ini sangat diduga menjalani EMT, yang berpotensi memungkinkan mereka untuk menyusup lebih baik ke dalam PE dan darah [ [ 47 ] ].

Selain itu, CTC EpCAM + dari kanker kolorektal dilaporkan menyatu dengan makrofag untuk membentuk sel hibrida sirkulasi CD45 + , yang menunjukkan peningkatan heterogenitas tumor dan perilaku metastasis [ [ 48 ] ].

Dengan demikian, dalam kasus di mana sel EpCAM + mengekspresikan CD45 secara bersamaan, kemanjuran penipisan sel CD45 + yang berulang dapat terganggu. Lebih jauh, pengecualian subpopulasi sel EpCAM + /CD45 + dari fraksi sel yang terkuras tidak akan mempertahankan heterogenitas tumor MPE asli dan akan gagal mencerminkan sensitivitas obatnya secara andal. Untuk mengatasi keterbatasan ini, metode alternatif untuk penipisan sel, seperti penggunaan penanda sel imun yang berbeda, misalnya—kombinasi CD3 dan CD19 untuk limfosit dan CD11b untuk penipisan makrofag, yang telah ditemukan berlimpah dalam MPE [ [ 49 ] ], harus dieksplorasi.

5 Kesimpulan
Mengingat resistensi pengobatan yang meningkat setelah 1-2 tahun terapi yang ditargetkan pada NSCLC, DST diperlukan untuk membantu dalam keputusan pengobatan pada pengobatan lini berikutnya yang terbaik. Untuk menguji sensitivitas sel tumor, pertama-tama seseorang harus mengisolasinya. Dalam studi ini, beberapa teknik isolasi sel tumor dibandingkan untuk efisiensinya dalam memperkaya sel tumor dari MPE: pengayaan imunomagnetik sel epitel menggunakan EpCAM (sistem pemisahan sel MACS, Miltenyi Biotec), seleksi negatif melalui penipisan sel CD45 + imunomagnetik (MojoSort™ Human CD45 Nanobeads, BioLegend), dan pemisahan sel tumor berdasarkan ukuran yang memanfaatkan saringan sel (pluriStrainer®). Seleksi negatif melalui penipisan sel CD45 + imunomagnetik adalah teknik isolasi sel tumor yang paling efisien, menunjukkan tingkat pemulihan sel tumor tertinggi dan pengayaan lipatan sel tumor tertinggi. Lebih jauh, dengan memanfaatkan putaran pemisahan magnetik yang berulang, metode ini menghasilkan sampel di mana sel tumor mewakili sebagian besar sel, bahkan dalam sampel yang memiliki persentase sel tumor awal yang rendah (2–5%). Yang terpenting, hasil DST yang dilakukan pada sampel yang diperkaya berkorelasi dengan hasil klinis. Dengan demikian, metode yang disajikan di sini sangat menjanjikan untuk memfasilitasi keputusan pengobatan yang cepat dan andal bagi pasien NSCLC, yang membuka jalan bagi pendekatan terapeutik yang dipersonalisasi.