Abstrak
Genom Fusarium solani , patogen tanaman yang terkenal, mengkodekan berbagai polisakarida monooksigenase litik (LPMO) yang terlibat dalam degradasi biomassa tanaman dalam kombinasi dengan dehidrogenase selobiosa (CDH). Untuk menyelidiki peran tambahan dari CDH kelas III yang baru-baru ini diekspresikan dan dikarakterisasi dari F. solani ( Fs CDH), enzim ini diuji dalam kombinasi dengan AA9C yang dikarakterisasi dengan baik dari Neurospora crassa ( Nc AA9C). Metode keadaan tetap dan aliran terhenti serta pengukuran elektrokimia menunjukkan bagaimana Fs CDH secara efisien mentransfer elektron ke Nc AA9C, dengan konstanta laju reoksidasi heme yang cepat dan teramati sebesar 129 s −1 . Dibandingkan dengan CDH kelas II ascomycete, produksi H 2 O 2 oleh Fs CDH tidak cukup untuk meningkatkan aktivitas LPMO. Namun, kaskade siklik antara Nc AA9C dan Fs CDH ditemukan. Produk reaksi Nc AA9C menunjukkan efisiensi katalitik yang tinggi sebagai substrat Fs CDH, dengan nilai K M mendekati substrat alaminya, selobiosa. Reaksi ini diteliti lebih lanjut melalui pengukuran waktu nyata, di mana Fs CDH dan Nc AA9C diinkubasi dengan selulosa yang membengkak akibat asam fosfat dan reaksinya berlangsung dalam jangka waktu yang lama tanpa penambahan reduktor eksternal. Kelas III CDH yang baru mirip dengan kelas CDH lainnya, kecuali reaktivitasnya yang sangat rendah dengan oksigen molekuler, yang menunjukkan fungsi yang berbeda pada Ascomycota dibandingkan kelas II CDH. Temuan ini berkontribusi pada pemahaman yang lebih baik tentang degradasi selulosa oksidatif oleh jamur dan dengan demikian, pada aplikasi bioteknologi potensial untuk penggunaan biomassa yang berkelanjutan.
Singkatan
A A
kegiatan tambahan
CDH
dehidrogenase selobiosa
Fs CDH
selobiosa dehidrogenase dari Fusarium solani
LPMO
litik polisakarida monooksigenase
Nc AA9C
aktivitas tambahan polisakarida litik monooksigenase keluarga 9 dari Neurospora crassa
PASC
asam fosfat-selulosa yang membengkak
RDE
elektroda cakram berputar
Konstituen dinding sel tanaman seperti selulosa dan hemiselulosa merupakan sumber karbohidrat yang melimpah, tetapi kompleksitasnya membuat depolymerisasi dan ekstraksi menjadi sulit [ [ 1 – 3 ] ]. Jamur merupakan pendegradasi biomassa lignoselulosa yang efektif, dengan beberapa strategi metabolisme yang saling berhubungan yang melibatkan sejumlah besar enzim yang disekresikan. Di antara ini, CDH dan LPMO beroperasi bersama untuk meningkatkan degradasi fraksi selulosa dari biomassa tanaman [ [ 4 ] ]. Di antara enzim-enzim ini, litik polisakarida monooksigenase (LPMO, EC 1.14.99.53 – 1.14.99.56 , CAZy: AA9–11, AA13–17) mengkatalisis pembelahan oksidatif berbagai polisakarida. Reaksi dimulai dengan reduksi pusat tembaga enzim oleh donor elektron, diikuti oleh aktivasi kosubstrat hidrogen peroksida (H 2 O 2 ) di pusat tembaga [ [ 3 , 5 – 8 ] ]. Reaksi katalitik membelah ikatan glikosidik dengan memasukkan atom oksigen baik pada karbon C1 atau C4 yang berdekatan dengannya [ [ 6 , 9 , 10 ] ]. Dukungan tambahan dari dehidrogenase selobiosa (CDH, EC 1.1.99.18 , CAZy: AA3_1), enzim flavositokrom yang ada dalam sekretom jamur, terhadap LPMO pertama kali dicatat untuk menyediakan elektron ke LPMO [ [ 4 , 6 ] ]. Beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa CDH berinteraksi dengan LPMO dari berbagai spesies jamur, mendukung konservasi evolusi dari kemitraan redoks ini [ [ 4 , 11 , 12 ] ]. Kemudian, produksi H 2 O 2 kelas II CDH juga ditemukan mendukung aktivitas LPMO [ [ 13 , 14 ] ]. Dibandingkan dengan aktivitas dehidrogenasenya, aktivitas oksidase CDH rendah, dengan angka turnover sekitar 100 kali lebih rendah untuk O 2 daripada untuk akseptor elektron quinoid. Namun, aktivitas rendah ini cocok untuk meningkatkan aktivitas LPMO [ [ 14 ] ]. Di alam, aktivitas LPMO perlu disinkronkan dengan aksi enzim hidrolitik. Kemampuan untuk mengatur aktivitas LPMO melalui enzim tambahan CDH dapat memungkinkan jamur untuk menyetel depolymerisasi oksidatif sesuai dengan aktivitas hidrolitik menurut komposisi biomassa [ [ 6 ] ].
Untuk pekerjaan ini, analisis genomik awal Fusarium solani (taxid: 169388) menunjukkan bahwa serangkaian gen lpmo putatif yang beragam telah diidentifikasi, termasuk enam dari famili aktivitas tambahan (AA) 9, lima dari famili 11, satu dari famili 13, dua dari famili 14, dan satu dari famili 16. F. solani adalah jamur fitopatogen yang sangat adaptif dengan distribusi di seluruh dunia yang menginfeksi berbagai spesies tanaman, terutama menargetkan akar dan menyebabkan busuk lunak pada tahap pembusukan selanjutnya. Kisaran inangnya mencakup banyak tanaman pertanian yang signifikan seperti kacang-kacangan, kentang, dan cucurbits, yang mencerminkan sifat patogenik generalisnya [ [ 15 ] ]. Repertoar luas LPMO dengan spektrum substrat yang luas kemungkinan memainkan peran penting dalam degradasi berbagai polisakarida dinding sel tanaman, memfasilitasi infeksi dan perolehan nutrisi [ [ 16 ] ]. Aktivasi LPMO ini dapat terjadi melalui berbagai mekanisme [ [ 6 ] ] dimana CDH hanyalah salah satu kemungkinannya.
Variabilitas strategi degradasi biomassa jamur juga tercermin dalam keragaman filogenetik kelompok besar enzim CDH. Analisis filogenetik sebelumnya mengidentifikasi keberadaan empat kelompok atau kelas berbeda dalam CDH, beberapa di antaranya juga hadir dalam spesies yang sama [ [ 17 – 21 ] ]. Banyak CDH kelas I dan II telah dikarakterisasi dari waktu ke waktu, dengan kelas I hanya ditemukan pada jamur basidiomycete dan kelas II dari ascomycetes [ [ 19 , 22 – 30 ] ]. Mengenai CDH kelas III yang juga ditemukan dalam genom ascomycete, banyak upaya telah dilakukan untuk menghasilkan anggota aktif kelas ini hingga saat ini, ketika kelas III CDH aktif dari patogen tanaman di mana-mana F. solani diekspresikan dan dimurnikan secara heterolog [ [ 21 ] ]. Seperti yang diselidiki dalam pekerjaan sebelumnya [ [ 21 ] ], logo sekuens yang mengelilingi residu katalitik penting menunjukkan bahwa ini sangat terkonservasi di ketiga kelas CDH. Tidak ada perbedaan khusus kelas yang terdeteksi di wilayah-wilayah ini, kecuali di sekitar langsung His689 katalitik di kelas I Phanerochaete chrysosporium CDH ( Pc CDH). Di kelas I CDH, Ser687 dan Asn688 dilestarikan secara ketat, sedangkan di kelas II CDH, Asn pada posisi yang sama dilestarikan secara ketat, tetapi Ala (74,4%) dapat digantikan oleh Ser (24,4%). Sebaliknya, di kelas III CDH seperti F. solani CDH, posisi sebelum His katalitik kurang dilestarikan, dengan Ser663 (43,7%) ditemukan dalam frekuensi yang sama dengan Asp (44,5%). Selain itu, posisi yang sesuai dengan Ser687 kelas I digantikan oleh Gly yang sangat dilestarikan di kelas III. Karena Ser687 dari Pc CDH membentuk ikatan hidrogen dengan rantai polipeptida utama yang dekat dengan substrat [ [ 24 ] ], perubahan pada posisi ini mungkin tidak memiliki efek signifikan pada afinitas atau spesifisitas substrat. Meskipun demikian, residu Asn688 secara langsung terlibat dalam ikatan hidrogen dengan substrat di CDH kelas I dan II, tetapi tidak ada di CDH kelas III, yang mungkin mengakibatkan afinitas atau spesifisitas substrat yang bervariasi. Untuk CDH kelas I dan II, efisiensi katalitik tertinggi dilaporkan terhadap selobiosa dan selo-oligosakarida, sementara monosakarida seperti glukosa adalah substrat yang buruk. CDH kelas II dapat mengubah lebih banyak variasi mono- dan oligosakarida dan menunjukkan diskriminasi yang kurang ketat terhadap glukosa daripada CDH kelas I [ [ 31 ] ]. Karakterisasi awal Fs CDH menunjukkan aktivitas spesifik dengan selobiosa sebesar 0,8 U·mg −1pada pH 6,0 menggunakan uji DCIP [ [ 21 ] ]. Aktivitas ini lebih rendah dibandingkan dengan kelas I Pc CDH dan kelas II Mt CDH (dari Myriococcum thermophilum , sinonim. Thermothelomyces myriococcoides ). Hunian FAD rendah (9%) dari Fs CDH yang diekspresikan secara rekombinan sebagian bertanggung jawab atas penurunan aktivitas ini, dan aktivitas yang dihitung ulang untuk hunian FAD 100% hanya sedikit lebih rendah daripada Mt CDH kelas II dalam kondisi yang sama [ [ 21 ] ]. PH optimum untuk kelas I CDH biasanya asam, sedangkan beberapa kelas II CDH juga bekerja dalam kondisi netral atau sedikit basa, yang mungkin merupakan adaptasi terhadap gaya hidup jamur [ [ 31 ] ] . Kondisi yang diuji sejauh ini menunjukkan pH optimum Fs CDH yang sedikit asam. Hal ini mendorong kami untuk menggunakan AA9C yang berkarakterisasi dengan baik dari Neurospora crassa ( Nc AA9C) untuk menyelidiki interaksi CDH kelas III yang baru dikarakterisasi ini dengan LPMO. Nc AA9C memiliki pH optimum yang mirip dengan Fs CDH, dan sebagai tambahan, N. crassa menghasilkan dua CDH kelas II yang berkarakterisasi dengan baik dengan kemiripan dengan Fs CDH [ [ 21 , 28 ] ].
Studi ini menyelidiki fungsi tambahan dari CDH kelas III yang baru dikarakterisasi ini pada Nc AA9C yang dikarakterisasi dengan baik dan menyelidiki sifat pemindahan elektronnya serta kemampuannya untuk menghasilkan H 2 O 2 , yang belum diuji sejauh ini. Studi ini juga menyelidiki kemungkinan kaskade katalitik antara depolymerizing dan enzim tambahan dengan menguji produk reaksi LPMO sebagai substrat CDH. Hipotesis yang akan diuji adalah bahwa ketika Nc AA9C membelah selulosa, ia menghasilkan campuran selobiosa dan selo-oligosakarida serta bentuk-bentuk teroksidasi C4 mereka [ [ 32 ] ] yang selanjutnya digunakan oleh CDH sebagai substrat. CDH yang direduksi kemudian akan dapat mereduksi pusat tembaga LPMO dan dengan demikian mempertahankan siklus reaksi. Fs CDH, sebagai anggota pertama yang dikarakterisasi dari CDH kelas III, digunakan sebagai representatif untuk menguji apakah ia dapat menyediakan fungsi tambahan ini serta kelas CDH lainnya dan mendukung LPMO dalam berbagai jamur tanpa CDH kelas I dan II. Sejauh ini, produk pemecahan selulosa teroksidasi seperti Glc4KGlc atau bentuk terhidrasinya Glc4gemGlc (tata nama diambil dari Ref. [ [ 32 ] ]) belum dianggap sebagai substrat untuk CDH dan akan diuji dalam penelitian ini. Ketika oligosakarida teroksidasi dan tidak teroksidasi yang diproduksi oleh LPMO dapat berfungsi sebagai substrat untuk CDH, kaskade siklik ini dapat dipertahankan sendiri dan bahkan mungkin dimulai sendiri (Gbr. 1 ). Mempelajari aktivitas dan interaksi kedua enzim menjadi fokus penelitian ini.
Gbr. 1
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Representasi skematis interaksi antara LPMO dan CDH. Berbagai jenis LPMO menghasilkan produk degradasi selulosa teroksidasi atau tidak teroksidasi, di antaranya kita temukan Glc4gemGlc, yang dapat menjadi substrat potensial untuk dioksidasi oleh domain dehidrogenase (CDH DH ) dari CDH. Elektron yang diekstraksi selama reaksi ini ditransfer melalui domain sitokrom (CDH Cyt ) ke akseptor elektron eksternal, seperti litik polisakarida monooksigenase (LPMO). Produksi H 2 O 2 oleh CDH yang mengoksidasi karbohidrat alih-alih menyumbangkan elektron ke LPMO menggunakan O 2 sebagai akseptor elektron tidak ditampilkan tetapi terjadi ketika CDH dan LPMO tidak dalam kontak dekat.
Bahan dan metode
Bahan kimia, larutan, dan enzim
Komponen penyangga dan bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini dibeli dengan kemurnian tertinggi yang tersedia dari Sigma (sekarang Merck, Darmstadt, Jerman), Fluka (Buchs, Swiss), Roth (Karlsruhe, Jerman), atau VWR (Radnor, PA, AS). Selulosa mikrokristalin (MCC) ( d = 50 μm, 11365, Avicel PH-101; Merck) digunakan untuk menyiapkan selulosa yang membengkak karena asam fosfat (PASC) sesuai dengan protokol yang dipublikasikan [ [ 33 ] ]. Enzim Fs CDH dan Nc AA9C yang digunakan dalam penelitian ini diproduksi secara heterolog dalam Komagataella phaffii syn. Pichia pastoris dalam bioreaktor 5-L dan kemudian dimurnikan dengan kromatografi cair protein cepat (FPLC), seperti yang dilaporkan sebelumnya [ [ 21 , 34 ] ].
Spektroskopi aliran terhenti untuk interaksi Fs CDH-LPMO
Kinetika pra-keadaan tunak yang mengukur laju reoksidasi Fs CDH oleh Nc AA9C dipelajari dengan spektrofotometri aliran terhenti (SX20; Applied Photophysics Ltd., Leatherhead, Inggris), seperti yang dijelaskan sebelumnya [ [ 35 ] ]. Rasio molar 1 : 1 dari 10 μ m Fs CDH terhadap selobiosa diinkubasi selama 30 detik untuk memungkinkan reduksi heme dan dicampur dengan cepat dengan konsentrasi 10 kali lebih tinggi dari 100 μ m LPMO menggunakan pengaturan mode sekuensial aliran terhenti. Reoksidasi heme dari Fs CDH dipantau pada 563 nm. Konstanta laju yang diamati ( k obs ) diukur pada pH 4,0, 5,0, dan 6,0 dalam buffer natrium asetat 50 mm dalam pengukuran kuadruplet.
Evaluasi Fs CDH sebagai agen pereduksi untuk Nc AA9C
Untuk menentukan apakah Fs CDH dapat bertindak sebagai agen pereduksi untuk Nc AA9C, kami memantau konsumsi H 2 O 2 secara real-time dengan pengaturan elektroda cakram berputar (RDE) [ [ 8 ] ]. Komponen reaksinya adalah: 30 mm buffer natrium asetat pH 5,0, 100 mm KCl , 4 g·L −1 xyloglucan sebagai substrat untuk Nc AA9C, 0,2 μ m Nc AA9C, berbagai konsentrasi (1–20 μ m ) Fs CDH, dan 1 mm selobiosa untuk mereduksi domain sitokrom Fs CDH. Ketika semua komponen kecuali Nc AA9C berada dalam sel reaksi, kurva kalibrasi diukur dengan mentitrasi sejumlah H 2 O 2 yang meningkat hingga konsentrasi akhir 100 μ m tercapai. Reaksi kemudian dimulai dengan menambahkan Nc AA9C, dan laju awal konsumsi H 2 O 2 diukur pada berbagai konsentrasi Fs CDH, seperti yang dijelaskan sebelumnya [ [ 8 ] ]. Kesalahan eksperimen meliputi kesalahan intraeksperimental yang berasal dari analisis regresi untuk penentuan laju dan kesalahan intereksperimental yang berasal dari, misalnya, kesalahan pipet.
Percobaan RDE untuk produksi H 2 O 2 oleh Fs CDH
Untuk memantau produksi H 2 O 2 oleh Fs CDH, sistem RDE yang disebutkan sebelumnya digunakan dalam dua kondisi berbeda. Pertama, 2 μ m Fs CDH diinkubasi dalam buffer natrium asetat 30 mm jenuh udara pH 5,0, dengan 100 mm KCl yang mengandung 10 mm selobiosa . Produksi H 2 O 2 dipantau menggunakan sensor RDE, dan kalibrasi sensor dilakukan sebelum akhir pengukuran dengan penambahan berturut-turut 10 μ m H 2 O 2 alikuot hingga konsentrasi 50 μ m . Kondisi kedua terdiri dari inkubasi 2 μ m Fs CDH dengan 8 mg·mL −1 selulosa yang membengkak akibat asam fosfat (PASC) yang dilarutkan dalam buffer yang sama. Sebagai percobaan referensi, 0,2 μ m Nc LPMO ditambahkan setelah 25 menit, dan setelah 30 menit, 50 μ m H 2 O 2 ditambahkan sebagai kosubstrat untuk Nc AA9C untuk menunjukkan bahwa Fs CDH aktif sebagai donor elektron.
Reaksi batch yang dipantau RDE untuk menghasilkan produk Nc AA9C
Reaksi batch memungkinkan untuk menghasilkan produk reaksi Nc AA9C menggunakan 16 g·L −1 dalam 4 mL selopentaosa sebagai substrat dan 5 m m asam askorbat sebagai agen pereduksi. Reaksi dilakukan dalam 30 m m buffer natrium asetat pH 5,0 yang dilengkapi dengan 100 m m KCl. Aktivitas Nc AA9C diukur secara real time dengan pengaturan RDE yang disebutkan sebelumnya [ [ 8 ] ]. H 2 O 2 dititrasi dalam langkah 50 μ m untuk mengisi kembali kosubstrat reaksi. Selain itu, 1 μ m Nc AA9C ditambahkan secara berkala untuk menggantikan aktivitas LPMO yang tidak aktif sendiri. Konversi substrat lengkap diverifikasi oleh pengamatan bahwa penambahan alikuot NcAA9C segar berikutnya tidak lagi menghasilkan konsumsi H 2 O 2 dan oleh analisis HPAEC-PAD dan MALDI-TOF-MS pada produk (Gbr. S2 ).
Pemurnian dan analisis selobiosa teroksidasi C′4
Penamaan selobiosa yang teroksidasi C′4 adalah Glc4gemGlc dan Glc4gemGlc yang teroksidasi C1 disebut Glc4gemGlc1A menurut Isaksen et al . [ [ 32 ] ]. Larutan reaksi pertama-tama dimurnikan dari enzim dan molekul yang lebih besar melalui penggunaan Amicon Ultra Centrifugal Filters (Merck Millipore, Darmstadt, Jerman) dengan batas 10 kDa. Aliran tersebut kemudian dimurnikan lebih lanjut dengan kromatografi pengecualian ukuran kinerja tinggi menggunakan manik-manik poliakrilamida P-2 Bio-Gel (Biorad, Hercules, CA, AS) dalam kolom XK 16/100 (Cytiva, Marlborough, MA, AS) yang diseimbangkan dalam air. Seluruh volume reaksi disuntikkan melalui loop injeksi 2 mL dalam dua langkah. Fraksi yang mengandung gula dielusi dengan aliran 0,5 mL·s −1 , dideteksi dengan memantau absorbansi pada 190 nm oleh detektor UV dari sistem ÄKTA murni (Cytiva), dan dikumpulkan. Fraksi yang dipilih kemudian dianalisis dengan kromatografi lapis tipis untuk identifikasi pertama produk (Gbr. S3 ), dengan pelarut campuran n -butanol/ n -propanol/etanol/air (2/3/3/2), mengikuti prosedur standar [ [ 36 ] ]. Fraksi yang mengandung selotriosa digabungkan, serta fraksi yang mengandung Glc4gemGlc, dan dimurnikan secara terpisah, dikeringkan beku, ditimbang, dan dilarutkan kembali dalam air murni untuk kuantifikasi yang tepat. Identitas Glc4gemGlc selanjutnya dikonfirmasi oleh kromatografi pertukaran anion kinerja tinggi-deteksi amperometrik berdenyut (HPAEC-PAD) dan spektrometri massa desorpsi/ionisasi-waktu terbang laser berbantuan matriks (MALDI-TOF-MS) (Gbr. S2 ). Analisis HPAEC dilakukan dengan sistem ICS-6000 (Dionex, Sunnyvale, CA, AS) yang dilengkapi dengan kolom CarboPac PA-1 (ID 2 mm × 250 mm; Dionex) dan kolom pelindung CarboPac PA (ID 2 mm × 50 mm; Dionex). 0,1 M natrium hidroksida (NaOH) dan 1 M natrium asetat dalam 0,1 M NaOH digunakan sebagai fase gerak. Metode elusi dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [ [ 37 ] ]. Data HPAEC-PAD diproses menggunakan Chromeleon 7.3.1 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AS). Analisis MALDI-TOF-MS dilakukan dengan sistem Autoflex maX LRF (Bruker Daltonics, Billerica, MA, AS). Pengaturan instrumen dan metode persiapan sampel telah dijelaskan sebelumnya [ [ 38 ] ]. Data MALDI-TOF-MS diproses menggunakan FlexAnalysis 3.4 (Bruker Daltonics).
Kinetika keadaan stabil Fs CDH menggunakan ketosugar sebagai substrat
Sebagian Glc4gemGlc mengalami perlakuan dengan β-glukosidase komersial dari biji almond (Sigma-Aldrich, sekarang Merck, Darmstadt, Jerman) untuk degradasi selo-oligosakarida yang mungkin tidak teroksidasi (yang telah diolah dengan Glc4gemGlc). Larutan stok β-glukosidase 2,5 U·mL −1 dalam 50 m m buffer kalium fosfat pH 6,0 disiapkan. Selanjutnya, larutan stok β-glukosidase 200 μL dicampur dengan 50 μL supernatan hingga mencapai konsentrasi 2 U·mL −1 . Reaksi diinkubasi dalam Eppendorf Thermomixer pada 800 rpm pada 37 °C selama 24 jam. Aktivitas katalitik Fs CDH kemudian dinilai dengan sampel yang diolah dengan Glc4gemGlc dan Glc4gemGlc menggunakan uji standar 2,6-diklorofenol indofenol (DCIP, ε 520 = 6,9 mm −1 · cm −1 ). Semua uji dilakukan dalam 50 mm buffer kalium fosfat pH 6,0, yang mengandung 0,3 mm DCIP dan konsentrasi dari 1 hingga 100 μ m Glc4gemGlc atau yang diolah dengan Glc4gemGlc, dari 1 μ m hingga 3 mm untuk selobiosa dan dari 3 μ m hingga 1 mm untuk selotriosa. Semua pengukuran dilakukan dalam rangkap tiga. Pengurangan DCIP dipantau menggunakan pembaca pelat EnSpire Multimode (PerkinElmer, Waltham, MA, AS) selama 3 menit, dan parameter kinetik dihitung dari laju awal dengan menyesuaikan data dengan persamaan Michaelis–Menten menggunakan regresi kuadrat terkecil nonlinier dalam sigmaplot 15.0 (Perangkat Lunak Systat, San Jose, CA, AS).
Reaksi berkelanjutan yang dipantau RDE Fs CDH- Sistem Nc AA9C
Kapasitas Fs CDH dan Nc AA9C untuk mempertahankan degradasi biomassa tanaman enzimatik dalam sistem reaksi yang digerakkan sendiri telah diperiksa menggunakan sistem RDE yang disebutkan sebelumnya, dengan selulosa yang membengkak akibat asam fosfat (PASC) sebagai substrat untuk Nc AA9C dan hanya Fs CDH sebagai agen pereduksinya. Campuran reaksi mengandung 10 μ m Fs CDH, 0,2 μ m Nc LPMO9C, dan 8 g·L −1 PASC dalam 30 mm buffer natrium asetat pH 5,0, dengan 100 mm KCl . Kalibrasi H 2 O 2 untuk sensor yang digunakan dilakukan di muka dan secara terpisah dalam sel reaksi yang berbeda. Reaksi dimulai dengan menambahkan 50 μ m H 2 O 2 ke dalam campuran. Titrasi tambahan H 2 O 2 memicu sistem, dan penambahan alikuot Nc AA9C lebih lanjut menangkal auto-inaktivasi enzim. Laju konsumsi H 2 O 2 dihitung pada setiap titrasi untuk menilai dinamika antara Fs CDH dan Nc AA9C.
Hasil
Transfer elektron antarprotein antara Fs CDH dan Nc AA9C
Reoksidasi kofaktor heme dalam domain sitokrom Fs CDH oleh Nc AA9C diukur untuk menyelidiki transfer elektron antarprotein. Laju pra-keadaan tunak dari reoksidasi ini dipelajari dengan spektrofotometri aliran-terhenti menggunakan mode sekuensial dalam kondisi aerobik. Pada awal percobaan, pusat redoks CDH dan LPMO berada dalam keadaan teroksidasi. Pertama, rasio molar Fs CDH dan selobiosa diinkubasi selama 30 detik untuk memungkinkan reduksi heme. Campuran tersebut kemudian ditembakkan terhadap LPMO yang 10 kali lipat lebih pekat, dan reoksidasi heme diikuti pada 563 nm. Hasil penelitian menunjukkan bahwa Fs CDH tereduksi selama periode inkubasi 30 detik pada pH 4,0 dan 5,0, tetapi hampir tidak ada pada pH 6,0. Hal ini menunjukkan transfer elektron antardomain yang sangat lambat dalam Fs CDH pada nilai pH tertinggi yang diuji dan menghilangkan pH ini dari kondisi percobaan yang berguna untuk mempelajari interaksi CDH-LPMO. Laju reoksidasi yang diamati pada pH 4,0 dan 5,0 keduanya sangat cepat, dengan nilai k obs masing-masing 126,4 ± 16,0 s −1 dan 129,3 ± 53,4 s −1 .
Fs CDH mampu secara efektif mengurangi Nc AA9C
Setelah mengkarakterisasi transfer elektron interprotein antara Fs CDH dan Nc AA9C, kami mengevaluasi efisiensi Fs CDH sebagai donor elektron untuk Nc AA9C dalam kondisi pergantian steady-state. Untuk menilai konsentrasi jenuh Fs CDH untuk interaksinya dengan Nc AA9C, kami memantau konsumsi H 2 O 2 oleh Nc AA9C setelah direduksi oleh Fs CDH. Pengaturan elektroda cakram berputar (RDE) dengan elektroda emas yang dimodifikasi dengan warna biru Prusia digunakan untuk tujuan ini [ [ 8 ] ]. Laju konsumsi awal H 2 O 2 diukur untuk konsentrasi Nc AA9C 0,2 μ m yang tetap dan konsentrasi Fs CDH yang bervariasi (1–20 μ m ) . Hasilnya menunjukkan bahwa terdapat peningkatan linier pada laju konsumsi H 2 O 2 hingga 5 μ m Fs CDH, mencapai saturasi pada konsentrasi yang lebih tinggi dengan laju konsumsi H 2 O 2 sebesar 1,3 μ m ·s −1 pada 20 μ m Fs CDH (Gbr. 2 ). Titrasi kedua percobaan ini dengan 100 μ m H 2 O 2 menunjukkan hasil yang sama tetapi mengungkap penurunan laju konsumsi H 2 O 2 dan dengan demikian aktivitas Nc AA9C, mungkin karena inaktivasi diri [ [ 8 ] ].
Gambar 2
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Konsumsi H 2 O 2 oleh Nc AA9C. Pemantauan aktivitas Nc AA9C dengan berbagai konsentrasi Fs CDH sebagai agen pereduksi. Substrat Nc AA9C terdiri dari 4 g·L −1 xyloglucan. Domain sitokrom dari Fs CDH direduksi dengan menginkubasi enzim dengan 1 m m selobiosa. Reaksi dimulai dengan menambahkan 0,2 μ m Nc AA9C. Titik-titik biru menunjukkan laju yang dihitung setelah titrasi pertama dengan 100 μ m H 2 O 2 , sedangkan titik data kuning diperoleh setelah titrasi kedua dengan 100 μ m H 2 O 2 . Kesalahan baku pengukuran (batang) terdiri dari data dari tiga replikasi teknis.
Pembentukan hidrogen peroksida oleh Fs CDH
Kemampuan Fs CDH untuk menggunakan oksigen sebagai akseptor elektron dan dengan demikian memasok H 2 O 2 untuk mendorong aktivitas peroksigenase LPMO diselidiki menggunakan pengaturan RDE. Pengukuran dilakukan menggunakan selobiosa atau PASC sebagai substrat untuk Fs CDH (Gbr. 3 ). Dalam kedua kasus, tidak ada akumulasi H 2 O 2 yang signifikan yang dapat dideteksi, yang menunjukkan bahwa Fs CDH tidak menghasilkan jumlah H 2 O 2 yang dapat dideteksi menggunakan metodologi yang diterapkan. Ini berbeda dengan CDH kelas II yang diselidiki dari M. thermophilum atau N. crassa . Namun, percobaan kontrol (Gbr. 3B ) menggunakan PASC sebagai substrat menunjukkan bahwa penambahan LPMO dan H 2 O 2 dapat memulai konversi katalitik yang mengarah pada penipisan lengkap H 2 O 2 yang tersedia dan memverifikasi fungsi donor elektron dari Fs CDH kelas III.
Gambar 3
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Produksi H 2 O 2 – oleh Fs CDH. (A) Fs CDH (2 μ m , panah merah) ditambahkan ke larutan buffer jenuh udara yang mengandung 10 m m selobiosa. Tidak ada produksi H 2 O 2 – yang dipantau menggunakan sensor RDE. Kalibrasi sensor dilakukan sebelum akhir pengukuran dengan penambahan aliquot H 2 O 2 – berturut-turut (10 μ m per penambahan, panah abu-abu). (B) Tidak ada deteksi produksi H 2 O 2 – oleh Fs CDH (2 μ m , panah merah) dengan adanya PASC (8 mg·mL −1 ). Untuk memverifikasi fungsi tambahan Fs CDH, 0,2 μ m Nc AA9C (panah biru) ditambahkan setelah 25 menit dan 50 μ m H 2 O 2 setelah 30 menit.
Pengujian kaskade siklik Fs CDH dan Nc AA9C
Konversi kaskadis produk reaksi Nc AA9C oleh Fs CDH dipelajari. Aktivitas Fs CDH terhadap produk reaksi yang tidak teroksidasi, selobiosa, telah ditetapkan [ [ 21 ] ], tetapi LPMO yang bekerja pada C4 seperti Nc AA9C juga menghasilkan gula teroksidasi. Untuk mempelajari apakah produk reaksi LPMO teroksidasi merupakan substrat yang cocok untuk CDH, reaksi batch yang menggunakan Nc AA9C, H 2 O 2 sebagai kosubstrat, dan asam askorbat sebagai agen pereduksi dilakukan untuk mengubah 64 mg selopentaosa. Reaksi diikuti dengan pemantauan konsumsi H 2 O 2 oleh Nc AA9C dengan pengaturan elektroda RDE, sementara mentitrasi H 2 O 2 bertahap untuk memberi makan reaksi. Untuk mengimbangi inaktivasi diri enzim, penambahan Nc AA9C berturut-turut dilakukan hingga konversi substrat lengkap (Gbr. S1 ). Seperti yang ditemukan sebelumnya [ [ 32 ] ], reaksi ini menghasilkan selotriosa yang tidak teroksidasi dan Glc4gemGlc yang teroksidasi C′4. Produk reaksi kemudian dipanen dan dimurnikan. Analisis HPAEC-PAD menunjukkan bahwa Glc4gemGlc adalah komponen utama setelah pemurnian, yang selanjutnya dikonfirmasi oleh analisis MALDI-TOF-MS (Gbr. S2 ).
Produk reaksi Nc AA9C yang tidak teroksidasi adalah substrat untuk Fs CDH
Selobiosa dan selotriosa yang tersedia secara komersial dievaluasi sebagai substrat untuk Fs CDH menggunakan uji DCIP standar, dan konstanta kinetik kondisi mapan ditentukan (Tabel 1 ). Untuk selobiosa, Fs CDH menunjukkan nilai K M sebesar 21,4 μ m , sedangkan nilai K M yang sedikit lebih rendah sebesar 16,1 μ m dihitung untuk selotriosa. Kedua substrat menunjukkan efisiensi katalitik yang sama ( k cat / K M ) masing-masing sebesar 0,06 dan 0,07 μ m −1 ·s −1 dan menunjukkan bahwa selobiosa dan selo-oligosakarida yang tidak teroksidasi adalah substrat yang sangat baik untuk tindakan tambahan Fs CDH.
Tabel 1. Kinetika kondisi mapan Fs CDH yang diukur dengan uji DCIP standar dalam pembaca pelat untuk selobiosa, selotriosa, Glc4gemGlc, dan Glc4gemGlc setelah perlakuan dengan β-glukosidase dari biji almond.
Produk reaksi Nc AA9C yang teroksidasi merupakan substrat untuk Fs CDH
Produk reaksi Nc AA9C, Glc4gemGlc, dievaluasi sebagai substrat untuk Fs CDH menggunakan uji DCIP standar yang sama. Larutan Glc4gemGlc digunakan sebagaimana adanya atau setelah perlakuan dengan β-glukosidase komersial (yang diolah dengan Glc4gemGlc) untuk mendegradasi selo-oligosakarida yang mungkin tidak teroksidasi. Nilai K M dari Fs CDH untuk Glc4gemGlc adalah 30,6 ± 8,3 μ m , yang menunjukkan afinitas pengikatan yang baik untuk substrat ini. Efisiensi katalitik keseluruhan adalah 0,06 μ m −1 ·s −1 . Karena jumlah substrat yang terbatas, kami tidak dapat mencapai saturasi untuk sampel yang diolah dengan Glc4gemGlc. Oleh karena itu, hanya efisiensi katalitik yang dihitung dari fase linier awal, dengan hasil serupa sebesar 0,06 μ m −1 ·s −1 . Ini menunjukkan untuk pertama kalinya bahwa produk reaksi LPMO teroksidasi seperti Glc4gemGlc merupakan substrat yang sangat baik untuk CDH, mirip dengan selobiosa.
Interaksi CDH-LPMO dapat didorong sendiri
Untuk menguji interaksi kaskadis Fs CDH dan Nc AA9C dalam jangka waktu lama dan mengonfirmasi kemandirian sistem enzimatik ini, kemampuan Fs CDH untuk bertindak sebagai satu-satunya agen pereduksi untuk Nc AA9C dan produk reaksi LPMO sebagai substrat untuk CDH, reaksi batch dilakukan. Pengaturan tersebut terdiri dari sel elektrokimia 4 mL untuk memantau konsumsi H 2 O 2 oleh LPMO secara real time. Selulosa yang membengkak akibat asam fosfat (PASC) dipilih sebagai substrat untuk Nc AA9C, karena ujung pereduksi rantai selulosa harus dapat diakses oleh CDH untuk memulai reaksi dengan cepat tanpa perlu menambahkan selobiosa tambahan. Fs CDH adalah satu-satunya donor elektron yang ada dan diinkubasi bersama dengan Nc AA9C dan PASC. Reaksi dimulai dengan penambahan 50 μm H2O2 dan titrasi H2O2 lebih lanjut dilakukan ketika penambahan sebelumnya dikonsumsi oleh Nc AA9C (Gbr. 4A ) . Untuk mengompensasi inaktivasi diri Nc AA9C, beberapa langkah titrasi H2O2 berikutnya disertai dengan penambahan alikuot segar enzim. Laju konsumsi H2O2 untuk setiap langkah titrasi dihitung (Gbr. 4B , Tabel S1 ), yang menunjukkan bagaimana reaksi dapat berlanjut secara stabil dari waktu ke waktu, hingga mencapai plateau sekitar 0,5 μm · s − 1 . Ini terjadi tanpa penambahan substrat di- atau oligo-sakarida untuk Fs CDH. Untuk lebih menegaskan peran CDH sebagai donor elektron yang diperlukan dalam reaksi ini, percobaan kontrol dilakukan tanpa adanya Fs CDH, yang menunjukkan bahwa Nc AA9C tidak dapat mengonsumsi H 2 O 2 secara efisien kecuali reduktor seperti asam askorbat ditambahkan (Gbr. S4 ). Hal ini menunjukkan bahwa ujung glukosa pereduksi awal dari PASC dan kemudian produk Nc AA9C cukup untuk berfungsinya Fs CDH.
Gambar 4
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Pemantauan waktu nyata konsumsi H 2 O 2 Nc AA9C dengan Fs CDH sebagai donor elektron. (A) Konsumsi H 2 O 2 dari Nc AA9C dipantau secara daring oleh pengaturan RDE menggunakan elektrode emas yang dimodifikasi dengan warna biru Prusia dan (B) laju konsumsi H 2 O 2 terhitung untuk percobaan yang sama. Campuran reaksi terdiri dari 10 μ m Fs CDH sebagai donor elektron untuk 0,2 μ m Nc AA9C, 8 g·L −1 PASC sebagai substrat untuk LPMO, dalam 30 mm buffer natrium asetat pH 5,0, 100 mm KCl . Dalam pengaturan ini, Fs CDH menggunakan selo-oligosakarida yang terdapat dalam campuran PASC sebagai substrat. Reaksi dimulai dengan menambahkan 50 μ m H 2 O 2 . Dalam (B) titik data merah menunjukkan laju yang dihitung dari pengukuran yang diambil setelah penambahan 50 μ m H 2 O 2 . Karena laju yang menurun diamati setelah beberapa titik titrasi, kemungkinan besar karena inaktivasi otomatis Nc AA9C, titik data biru menunjukkan kemiringan yang dihitung dari pengukuran yang dilakukan setelah penambahan 0,2 μ m Nc AA9C dan 50 μ m H 2 O 2 . Kesalahan baku pengukuran (batang) terdiri dari data dari tiga replikasi teknis.
Diskusi
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menyelidiki perilaku anggota kelas III Fs CDH yang baru dikarakterisasi dalam interaksi katalitiknya dengan Nc AA9C yang terkenal [ [ 34 ] ]. Pengujian pertama transfer elektron antara dua enzim, yang merupakan interaksi pertama yang ditemukan antara kedua enzim [ [ 4 , 6 , 10 ] ], baik percobaan aliran terhenti dan RDE mengkonfirmasi bahwa Fs CDH dapat secara efisien bertindak sebagai donor elektron untuk Nc AA9C dan dengan demikian menggantikan reduktan molekuler kecil seperti asam askorbat, asam galat, dll. Meskipun asal enzim berbeda, laju transfer elektron antarprotein yang diukur adalah yang tertinggi yang pernah diukur sejauh ini [ [ 8 ] ]. Analisis kinetik Fs CDH mengungkap perilaku yang serupa dengan kelas I Pc CDH, di mana selobiosa juga merupakan substrat pilihan, menunjukkan K M 0,08 mm dan k cat 27,8 s −1 , dan dengan kelas II CDH ( Nc CDH) dengan K M 0,05 mm dan k cat 24 s −1 saat diuji dalam kondisi serupa [ [ 39 , 40 ] ]. Analisis kinetik pra-keadaan tunak menunjukkan bahwa domain sitokrom CDH dengan cepat dioksidasi ulang oleh Nc AA9C pada pH 4,0 dan 5,0. Hasil ini sesuai dengan penelitian sebelumnya, di mana sistem CDH-LPMO antarspesies juga dipelajari, menggunakan CDH dari Crassicarpon hotsonii (sinonim. M. thermophilum ) dan LPMO yang sama yang digunakan dalam penelitian ini [ [ 41 ] ]. Di sana, laju orde kedua sebesar 9,87 × 10 5 m −1 ·s −1 diperoleh pada pH 4,5, yang sedikit lebih rendah daripada yang diperoleh dalam penelitian ini untuk Fs CDH- Nc AA9C: sekitar 1,3 × 10 6 m −1 ·s −1 untuk pH 4,0 dan 5,0. Menariknya, transfer elektron antardomain Fs CDH pada pH 6,0 lebih lambat daripada waktu eksperimen, yang menunjukkan transfer elektron antardomain yang sangat lambat pada kondisi yang mendekati netral. Perilaku yang bergantung pada pH ini mirip dengan CDH kelas I dari P. chrysosporium [ [ 42 ] ]. Eksperimen RDE mengonfirmasi bahwa FsCDH dapat secara efektif mengaktifkan Nc AA9C pada pH 5,0, jumlah pergantian meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi Fs CDH, mencapai saturasi pada 20 μ m . Pengamatan ini mengonfirmasi data yang dilaporkan untuk sistem enzim Nc CDHIIA- Nc AA9C dalam pengaturan yang sama [ [ 8 ] ] dan menunjukkan bahwa CDH adalah donor elektron yang sangat efisien untuk LPMO.
Selain fungsinya untuk memasok elektron untuk reduksi awal pusat redoks tembaga LPMO, CDH telah terbukti menghasilkan H 2 O 2 melalui aktivitas sisi oksidasenya [ [ 3 , 6 , 14 ] ]. Dalam sebuah studi oleh Chang et al . menggunakan varian CDH rekayasa dengan reaktivitas oksigen yang meningkat, akumulasi H 2 O 2 dengan substrat tetapi tanpa adanya akseptor elektron kecuali oksigen dapat ditunjukkan menggunakan sensor amperometrik. Namun, dengan adanya LPMO, akumulasi H 2 O 2 tidak diamati, yang menunjukkan konsumsi langsung H 2 O 2 oleh LPMO dan mengonfirmasi bahwa produksi H 2 O 2 oleh CDH adalah langkah pembatas laju dalam aktivasi tambahan LPMO [ [ 7 ] ]. Studi ini menemukan bahwa Fs CDH asli memiliki reaktivitas yang sangat rendah terhadap oksigen dan bahkan tanpa adanya LPMO tidak menghasilkan sejumlah besar H 2 O 2 ketika diinkubasi dengan selobiosa atau PASC. Hasilnya menunjukkan bahwa Fs CDH mendukung aktivitas LPMO melalui transfer elektron langsung, tetapi tidak melalui pembentukan H 2 O 2 atau hanya pada tingkat yang sangat rendah dan tidak terdeteksi. Hal ini menyiratkan bahwa sumber H 2 O 2 eksternal lainnya diperlukan untuk mendorong katalisis Nc AA9C. Namun, kemungkinan produksi H 2 O 2 oleh LPMO dengan adanya Fs CDH sebagai reduktan tidak dapat dikesampingkan [ [ 34 ] ]. Bagaimanapun, aktivitas peroksigenase cepat LPMO dengan adanya substrat mencegah akumulasi jumlah H 2 O 2 yang terdeteksi [ [ 3 , 7 ] ].
Akhirnya, penelitian ini menyelidiki penggunaan substrat secara berjenjang antara kedua enzim. Produk reaksi Nc AA9C disiapkan dan bekerja dengan sempurna sebagai substrat untuk Fs CDH, sehingga terbentuklah siklus katalitik. Hasil penelitian menunjukkan bahwa Glc4gemGlc yang tidak teroksidasi (selobiosa, selotriosa) dan yang teroksidasi merupakan substrat yang efisien untuk Fs CDH, tercermin dalam nilai K M yang rendah yaitu 21,4 ± 3,0 μ m untuk selobiosa, 16,1 ± 2,9 μ m untuk selotriosa, dan 30,6 ± 8,3 μ m untuk Glc4gemGlc. Untuk substrat yang tidak teroksidasi, perilaku ini sudah diketahui dan tidak mengejutkan. Perilaku ini mirip dengan Nc CDHIIA kelas II dengan K M 0,05 mm dan k cat 24 s −1 untuk selobiosa saat diuji dalam kondisi yang serupa [ [ 40 ] ]. Anehnya, kemampuan Fs CDH untuk bereaksi dengan gula teroksidasi dan konfigurasi substrat Glc4gemGlc masih sesuai dengan situs aktif CDH.
Dengan mempertimbangkan semua aspek yang dibahas di atas, percobaan RDE akhir dilakukan untuk memperoleh gambaran umum tentang interaksi antara Fs CDH dan Nc AA9C pada kondisi pergantian yang lama. Dalam reaksi ini, Fs CDH adalah satu-satunya sumber elektron, dan degradasi PASC oleh Nc AA9C menyediakan substrat untuk CDH. Penambahan kosubstrat LPMO H 2 O 2 dalam langkah-langkah titrasi diskrit diperlukan karena tidak atau hanya diproduksi secara tidak cukup oleh Fs CDH. Namun, laju produksi H 2 O 2 yang sangat rendah oleh Fs CDH juga merupakan keuntungan, yang memungkinkan pengukuran pergantian H 2 O 2 yang tepat oleh Nc AA9C. Titrasi dengan H 2 O 2 menghasilkan konsentrasi H 2 O 2 yang relatif tinggi yaitu 50 μ m , yang menyebabkan penonaktifan cepat Nc AA9C , seperti yang ditunjukkan dalam penelitian sebelumnya [ [ 8 , 14 ] ]. Konsumsi H 2 O 2 stabil yang diamati mendukung hipotesis bahwa CDH dan LPMO dapat membentuk kaskade enzimatik mandiri di mana produk depolymerisasi yang dihasilkan LPMO bertindak sebagai substrat CDH, yang pada gilirannya meningkatkan siklus degradasi oksidatif dalam mekanisme yang mungkin menyerupai degradasi lignoselulosa jamur dalam kondisi fisiologis.
Dalam penelitian ini, kami menyelidiki interaksi antara Fs CDH yang baru dikarakterisasi, yang termasuk dalam kelas CDH yang baru dikarakterisasi bersama dengan Nc AA9C yang terkenal untuk mengeksplorasi interaksinya. Secara keseluruhan, temuan kami memajukan pemahaman tentang rute mekanistik kompleks yang terlibat dalam degradasi selulosa oksidatif oleh jamur, yang tidak hanya menyangkut implikasi ekologis tetapi juga aplikasi bioteknologi untuk penggunaan biomassa yang berkelanjutan.
