Bias terkait EMT dalam sistem Parsortix® diamati pada lini sel kanker pankreas

Abstrak
Kanker pankreas memiliki tingkat kelangsungan hidup 5 tahun sebesar 12%, yang menyoroti perlunya biomarker yang andal untuk deteksi dini dan pemantauan penyakit. Sel tumor yang bersirkulasi (CTC) telah muncul sebagai biomarker yang menjanjikan, namun deteksinya masih menantang. Studi ini mengevaluasi sistem Parsortix®, perangkat mikrofluida yang memperkaya CTC berdasarkan ukuran dan deformabilitas, menggunakan lini sel kanker pankreas. Karena semakin banyak bukti yang menunjukkan bahwa selama transisi epitel ke mesenkim (EMT), deformabilitas sel meningkat, kami mengevaluasi kemungkinan bias oleh perangkat tersebut. Tahap EMT dari tiga lini sel kanker pankreas, CAPAN-1, MIA PaCa-2, dan PANC-1, dinilai untuk mengklasifikasikannya sebagai epitel, mirip mesenkim, dan hibrida. Percobaan spike-in menunjukkan bahwa fenotipe epitel dan hibrida ditangkap lebih efisien (62,6 ± 18,5% dan 65,4 ± 11,1%) daripada sel kanker mirip mesenkim (32,8 ± 10,2%). Hasil ini dikonfirmasi menggunakan lini sel kanker payudara yang dapat diinduksi EMT. Tingkat pemulihan yang lebih rendah ditemukan untuk sel dalam keadaan mirip mesenkim (31,5 ± 6,4%) daripada sel dalam keadaan epitel (47,56 ± 7,2%). Sebagai kesimpulan, perangkat Parsortix® mungkin meremehkan jumlah CTC mesenkim.

Singkatan
ACN
asetonitril
APC
alofikosianin
CA19-9
karbohidrat antigen 19-9
CD49f
integrin α6
CDH1
kadherin-1/E-kadherin
CDH2
kadherin-2/ N-kadherin
CLDN4
claudin 4
CTC
sel tumor yang bersirkulasi
DAPI
4′,6-diamidino-2-fenilindol
DIA
analisis data independen
Bahasa Indonesia: DMEM
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (Mata Elang yang dimodifikasi)
DOX
doksisiklin
E/P
epitel/mesenkim
Petugas medis
transisi epitel ke mesenkim
EPCAM
molekul adhesi sel epitel
Bahasa Inggris
asam format
FBS
serum janin sapi
Klub Sepak Bola
lipat perubahan
Bahasa Indonesia: FDR
tingkat penemuan palsu
Bahasa Indonesia: FITC
fluorescein isothiosianat
FN1
fibronektin-1
Mahkamah Konstitusi
imunokimia
Bahasa Inggris
kromatografi cair
MS
spektrometri massa
Tidak ada
jaringan saraf
Bahasa Inggris OCLN
okludin
Catatan:
penisilin/streptomisin
pan-CK
pan-sitokeratin
Bahasa Indonesia: PBS
garam penyangga fosfat
PBST+
PBS dengan 0,5% BSA, 0,1% Triton X-100 dan 2% serum kambing
qRT PCR (teknik pemeriksaan PCR)
reaksi berantai polimerase transkriptase balik kuantitatif
BATU 1
Kinase protein terkait Rho
SD
simpangan baku
STR
pengulangan tandem pendek
VIM
vimentin
Bahasa Indonesia: ZEB1
jari seng E-box-mengikat homeobox 1

1 Pendahuluan
Kanker pankreas adalah penyebab kematian terkait kanker ketiga, dengan tingkat kelangsungan hidup 5 tahun hanya 12% [ [ 1 ] ]. Pasien jarang menunjukkan gejala pada stadium awal, sehingga lebih dari 50% pasien didiagnosis pada stadium lanjut [ [ 2 ] ]. Tingginya insiden diagnosis stadium akhir dan prognosis buruk berikutnya menekankan perlunya biomarker yang andal untuk deteksi dini, pemantauan penyakit berkelanjutan, dan pengambilan keputusan klinis untuk meningkatkan kelangsungan hidup pasien [ [ 2 , 3 ] ]. Saat ini, Carbohydrate Antigen 19-9 (CA19-9) adalah satu-satunya biomarker berbasis darah yang disetujui FDA untuk kanker pankreas, meskipun sensitivitas dan spesifisitasnya rendah. Biomarker menjanjikan lainnya disarankan, termasuk sel tumor yang bersirkulasi (CTC), vesikel ekstraseluler, RNA bebas sel, protein, dan DNA bebas sel. CTC adalah sel tumor yang telah terlepas dari tumor primer dan memasuki aliran darah, tempat mereka dapat melakukan perjalanan ke organ yang jauh dan berpotensi membentuk metastasis. Kehadiran mereka dalam aliran darah telah dikaitkan dengan prognosis yang buruk pada beberapa jenis kanker, misalnya kanker payudara [ [ 4 ] ], prostat [ [ 5 ] ], dan kolorektal [ [ 6 ] ]. Namun, mendeteksi dan menganalisis CTC masih menjadi tantangan karena kelangkaannya [ [ 7 ] ]. Sejak disetujui FDA pada tahun 2004, sistem CellSearch® telah menjadi salah satu perangkat yang paling banyak digunakan untuk mendeteksi CTC, mengandalkan pengayaan imunomagnetik yang menargetkan molekul adhesi sel epitel penanda permukaan epitel (EPCAM) [ [ 8 ] ]. Perangkat ini telah diuji secara ekstensif untuk beberapa jenis kanker (termasuk kanker payudara, prostat, dan kolorektal); namun, untuk kanker pankreas, tingkat deteksi CTC agak rendah [ [ 9 , 10 ] ]. Salah satu kemungkinan penjelasan untuk ini adalah transisi epitel-ke-mesenkimal (EMT) sel kanker. EMT adalah proses seluler di mana sel-sel epitel kehilangan karakteristiknya, seperti polaritas apikal-basal dan adhesi sel-ke-sel, dan beralih menjadi fenotipe mesenkimal, memperoleh peningkatan kemampuan invasif dan migrasi [ [ 11 , 12 ]]. Dengan demikian, EMT menghasilkan populasi CTC heterogen, di mana sel-sel mungkin memiliki fenotip epitel atau mesenkimal, atau ada dalam keadaan epitel/mesenkimal (E/M) intermediet, yang mengekspresikan penanda kedua keadaan tersebut, yang dikenal sebagai CTC hibrida E/M. Lebih jauh lagi, minat dalam mengkarakterisasi populasi CTC berdasarkan penanda epitel dan mesenkimal telah meningkat dalam beberapa tahun terakhir, karena keadaan diferensiasi ini dapat menawarkan informasi tambahan tentang stadium tumor dan prognosis pasien. CTC mirip mesenkimal dilaporkan lebih invasif dengan potensi metastasis yang lebih tinggi daripada CTC epitel [ [ 13 ] ]. Pada kanker pankreas, penelitian telah menunjukkan bahwa keberadaan CTC hibrida E/M dan CTC mirip mesenkimal berkorelasi dengan perkembangan penyakit, sedangkan deteksi CTC epitel semata-mata tidak [ [ 14 , 15 ] ].

Untuk menangkap seluruh populasi CTC heterogen, teknik pengayaan berbasis ukuran yang independen dari epitop telah menjadi semakin populer. Di antara sistem tersebut, hanya sistem Parsortix® yang disetujui FDA, meskipun terbatas pada kanker payudara metastasis [ [ 16 ] ]. Ini adalah perangkat mikrofluida semi-otomatis yang menangkap CTC dari darah utuh berdasarkan ukuran dan deformabilitasnya. Oleh karena itu, sistem Parsortix® tampaknya menjadi platform yang lebih tepat untuk deteksi CTC karena tidak hanya bergantung pada penanda epitel seperti EPCAM, yang sering kali mengalami penurunan regulasi selama perkembangan kanker yang didorong oleh EMT. Namun, ada semakin banyak bukti bahwa selama EMT modulus kekakuan Young sel menurun dan deformabilitas meningkat [ [ 17 ] ]. Karena sistem Parsortix® sebagian didasarkan pada deformabilitas, kami berhipotesis bahwa mungkin ada bias terhadap penangkapan CTC dalam keadaan epitel, yang kurang dapat dideformasi. Tujuan keseluruhan penelitian kami adalah untuk mengevaluasi kinerja sistem Parsortix® untuk mendeteksi sel kanker pankreas dengan berbagai fenotipe E/M.

2 Bahan dan Metode
2.1 Garis sel kanker pankreas
Tiga lini sel yang berasal dari tumor pankreas digunakan: CAPAN-1 (RRID: CVCL_0237), PANC-1 (RRID: CVCL_0480) dan MIA PaCa-2 (RRID: CVCL_0428). Sel CAPAN-1 dan PANC-1 diterima dari Laboratorium Penelitian Kanker Eksperimental Prof. Olivier De Wever (Rumah Sakit Universitas Ghent, Belgia). Sel MIA PaCa-2 dibeli dari DSMZ GmbH (No. ACC: ACC 733) [ [ 15 ] ]. Sel CAPAN-1 dan PANC-1 dikulturkan dalam medium Eagle yang dimodifikasi Dulbecco (DMEM, 41966029; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AS) yang mengandung 10% serum janin sapi (FBS) dan 1% penisilin/streptomisin (P/S). Sel MIA PaCa-2 dikulturkan dalam DMEM yang mengandung 10% FBS, 1% P/S, dan 2,5% serum kuda. Semua sel diinkubasi pada suhu 37 °C dan dalam 5% CO 2 . Kultur sel diperiksa secara berkala untuk mengetahui adanya kontaminasi mikoplasma dengan MycoAlert® Mycoplasma Detection Kit (LT07-118; Lonza, Basel, Swiss) sesuai dengan panduan pabrik pembuatnya. Semua lini sel yang digunakan dalam makalah ini diautentikasi menggunakan profil pengulangan tandem pendek (STR) dalam 3 tahun terakhir [ [ 18 ] ].

2.2 Konstruksi model seluler MCF7 iZEB1
Sel MCF7 (RRID: CVCL_0031) dikultur pada suhu 37 °C, dalam 5% CO 2 dalam DMEM dengan 10% FBS, 1% asam amino nonesensial (11140050; Thermo Fisher Scientific), 1% P/S, dan 6 ng·mL −1 insulin manusia (I9278-5ML; Merck Life Science bv, Amsterdam, Belanda). Kultur sel diperiksa untuk mengetahui adanya kontaminasi mikoplasma dengan MycoAlert® Mycoplasma Detection Kit (LT07-118; Lonza) sesuai dengan panduan pabrik pembuatnya. Sel MCF7 ditransduksi dengan vektor lentivirus pSIN-hZEB1-3xHA dan diseleksi dengan puromisin (1 μg·mL −1 ), yang memungkinkan ekspresi berlebih yang dapat diinduksi doksisiklin (DOX) dari faktor transkripsi ZEB1 yang menginduksi EMT. Sel-sel disemai dalam tabung kultur T25 dan diinkubasi selama 24 jam hingga mencapai konfluensi 20–30%. Untuk setiap percobaan spike-in, satu tabung diperlakukan dengan 1 μg·mL −1 DOX hyclate (D5207; Merck Life Science bv) selama 72 jam; media kultur segar tanpa DOX ditambahkan ke tabung kultur lainnya. Setelah 72 jam, status EMT dari kedua tabung ditentukan menggunakan mikroskopi, imunositokimia (ICC), dan qRT-PCR untuk memastikan bahwa sel-sel yang diperlakukan dengan DOX telah beralih ke status mesenkimal, sementara sel-sel yang tidak diperlakukan masih dalam status epitel.

2.3 Karakterisasi garis sel
2.3.1 Imunositokimia
Sel CAPAN-1, PANC-1, MIA PaCa-2, dan MCF7 iZEB1 digunakan untuk analisis imunositokimia. Sebanyak 100.000 sel per sumuran disemai pada slide bilik dengan delapan sumuran individual (80806; Ibidi, Grafelfing, Jerman). Sel MCF7 iZEB1 diobati dengan 1 μg·mL −1 DOX hyclate selama 72 jam. Setelah 3 hari, sel-sel tersebut dicuci dengan garam penyangga fosfat (PBS) dan difiksasi dalam paraformaldehida 4% selama 10 menit. Sel-sel tersebut dipermeabilisasi dan diblokir selama 1 jam dalam PBS dengan 0,5% BSA, 0,1% Triton X-100, dan 2% serum kambing (PBST+). Sel-sel yang telah mengalami permeabilisasi dicuci tiga kali dengan PBS dan diinkubasi semalaman pada suhu 4 °C dengan antibodi yang menargetkan E-Cadherin (CDH1) (610182, pengenceran 1 : 100; BD Biosciences, San Jose, CA, AS), antibodi vimentin (VIM) (ab92547, pengenceran 1 : 200; Abcam, Cambridge, Inggris), antibodi Zinc finger E-box-binding homeobox 1 (ZEB1) (HPA027524, pengenceran 1 : 400; Sigma, Burlington, MA, AS), pan-cytokeratin (pan-CK) (ab215838, pengenceran 1 : 100; Abcam), fibronectin-1 (FN1) (610078, pengenceran 1 : 100; BD Biosciences), CD44 (550538, pengenceran 1 : 100; BD Biosciences), N-kadherin (CDH2) (33-3900, pengenceran 1 : 100; Invitrogen, Carlsbad, CA, AS), klaudin 4 (CLDN4) (ab210796, pengenceran 1 : 100; Abcam) dan/atau EPCAM (ab213500, pengenceran 1 : 100; Abcam) yang diencerkan dalam PBST+. Keesokan harinya, sel-sel dicuci tiga kali dengan PBS dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu kamar dengan antibodi sekunder: antibodi keledai anti-tikus Alexa Fluor 488 (3553, pengenceran 1 : 500; Thermo Fisher Scientific) dan/atau antibodi kambing anti-kelinci Alexa Fluor 568 (A11036, pengenceran 1 : 2000; Thermo Fisher Scientific), dan 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (pengenceran 1 : 1000). Semua akuisisi dilakukan dengan mikroskop Nikon TiE (Melville, NY, AS) dengan Spectra X Light Engine (395, 440, 470, 510, 550, dan 640 nm). Gambar-gambar tersebut diperoleh dengan Kamera Mikroskop Digital Mono DS-Qi2, dengan lensa objektif Plan Apochromat CFI ×20/0,75NA melalui antarmuka perangkat lunak untuk elemen nis dengan laser pada 395 nm untuk pewarnaan balik DAPI, 470 nm untuk CDH1, dan 550 nm untuk VIM. Semua gambar diperoleh dengan daya laser, waktu akuisisi, dan penguatan yang sama.

2.3.2 Sitometri aliran
Sel CAPAN-1, PANC-1, dan MIA PaCa-2 dilepaskan dari tabung kultur T25 dengan EDTA/tripsin dan dikumpulkan dalam tabung 15 mL. Setelah disentrifugasi pada 500  g selama 5 menit pada suhu ruangan, pelet sel dicuci dengan PBS, dipindahkan ke tabung Eppendorf 1,5 mL, dan disentrifugasi lagi pada 500  g selama 5 menit pada suhu ruangan. PBS digunakan untuk mencuci sel di antara langkah-langkah yang berbeda. Pelet sel disuspensikan kembali dalam 50 μL buffer FACS (PBS dengan 1% FCS dan 1 mm EDTA ) dengan antibodi yang menargetkan EPCAM (GTX30708, pengenceran 1 : 200; GeneTex, Irvine, CA, AS), CDH2 (350812, pengenceran 1 : 200; BioLegend), CD49f (563706, pengenceran 1 : 100; BD Biosciences), CDH1 (752477, pengenceran 1 : 400; BD Biosciences), dan CD44 (21270446 s, pengenceran 1 : 200; Immunotools, Friesoythe, Jerman) dan diinkubasi selama 45 menit pada suhu ruangan. eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 (65-0865-14, pengenceran 1 : 1000; Thermo Fisher) ditambahkan dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruangan. Sel disentrifugasi pada 500  g selama 5 menit pada suhu ruangan, dicuci, difiksasi, dan dipermeabilisasi menggunakan eBioscience Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (00-5523-00; Thermo Fisher Scientific). Selanjutnya, sel disentrifugasi pada 1000  g selama 5 menit pada suhu ruangan. Pelet sel disuspensikan kembali dalam 50 μL buffer FACS dengan antibodi yang menargetkan VIM (677804, pengenceran 1 : 400; BioLegend), ZEB1 (3396, pengenceran 1 : 100; Cell Signaling, Danvers, MA, AS), dan CDH1 (755879, pengenceran 1 : 200; BD Biosciences), dan diinkubasi selama 45 menit pada suhu ruangan. Sel disentrifugasi pada 1000  g selama 5 menit dan dicuci. Pelet sel disuspensikan kembali dalam 50 μL buffer FACS dengan antibodi IgG anti-tikus Spark Red 718 (405318, pengenceran 1 : 400; BioLegend) dan anti-kelinci BV421 (406410, pengenceran 1 : 100; BioLegend) dan diinkubasi selama 45 menit pada suhu ruangan. Setelah disentrifugasi pada 1000  g selama 5 menit pada suhu ruangan, pelet sel disuspensikan kembali dalam 200 μL buffer FACS. Flow cytometry dilakukan dengan BD FACSymphony A3 (BD ​​Biosciences). Data dianalisis menggunakan perangkat lunak flowjo (v10.10.0) (Ashland, OR, AS).

2.3.3 PCR qRT
Setelah sel MCF7 iZEB1 diobati dengan 1 μg·mL −1 DOX hyclate selama 72 jam, RNA dimurnikan menggunakan Nucleospin RNA Plus 250 preps kit (740984.250; Macherey-Nagel, Duren, Jerman) sesuai dengan petunjuk pabrik pembuatnya. Konsentrasi RNA diukur dengan Nanodrop (ND-2000; Thermo Fisher Scientific). 1500 ng RNA ditranskripsi balik menjadi cDNA menggunakan SensiFast cDNA Synthesis Kit (BIO-650504; GC Biotech BV, Rijswijk, Belanda) sesuai dengan petunjuk pabrik pembuatnya. qRT-PCR dilakukan dengan SensiFast SYBR No-Rox Kit (CSA-01190; GC Biotech BV) pada sistem LightCycler 480 (Applied Biosystems, Waltham, MA, AS). Primer dirancang dengan perangkat lunak primer express (Perkin Elmer, Springfield, IL, AS) atau yang dijelaskan dalam literatur. Percobaan ini dilakukan dalam rangkap tiga. Perangkat lunak qBasePLUS (BioGazelle, Zwijnaarde, Belgia) diterapkan untuk analisis data berdasarkan metode deltaCT dan algoritma geNorm untuk menentukan gen referensi yang paling stabil. Tinjauan umum primer qRT-PCR untuk gen referensi dan target dapat ditemukan di Tabel S1 .

2.3.4 Analisis proteom sel tumor pankreas
2.3.4.1 Persiapan sampel
Sel-sel disemai dalam labu T75 dalam media kultur yang direkomendasikan dalam rangkap empat. Ketika kultur sel mencapai 70–80% konfluensi, sel-sel dicuci dengan PBS dan, saat dalam PBS, sel-sel dikikis dari dasar labu kultur dan dikumpulkan dalam tabung 15 mL. Suspensi sel disesuaikan menjadi 1 × 106 per sampel. Suspensi ini disentrifugasi pada 300  g selama 5 menit pada suhu kamar, dan pelet sel dibekukan dengan cepat dan disimpan pada suhu -80 °C hingga diproses lebih lanjut. Sampel disiapkan dalam rangkap empat untuk setiap lini sel. Sampel dilisiskan menggunakan protokol S-TRAP™ (Protifi, Fairport, NY, AS) dan disonikasi dengan sonikator probe. Lisat disentrifugasi pada 20.000  g selama 15 menit pada suhu ruangan dan konsentrasi protein dalam supernatan diukur menggunakan PierceTM BCA Protein Assay (23225 dan 23227; Thermo Fisher Scientific), setelah itu protein dicerna pada kolom mikrospin S-TRAPTM (Protifi). Untuk setiap sampel, 33,7 μg protein dimuat pada kolom. Setelah pencernaan (semalaman) dan elusi peptida, konsentrasi peptida diukur dengan DropSense-16.

2.3.4.2 Analisis LC–MS/MS
Peptida dilarutkan kembali dalam 20 μL pelarut pemuatan A [0,1% TFA dalam air : asetonitril (ACN) (99,5 : 0,5, v : v)] beberapa saat sebelum analisis. Dua mikroliter dari setiap sampel disuntikkan untuk kromatografi cair (LC)-spektrometri massa (MS)/analisis MS pada sistem Ultimate 3000 RSLCnano yang terhubung secara langsung ke spektrometer massa Q Exactive HF BioPharma (Thermo Fisher Scientific). Penangkapan dilakukan pada 20 μL·min −1 selama 2 menit dalam pelarut pemuatan A (0,5% ACN dalam air 0,1% TFA) pada kolom penangkapan PepMap 20 mm (Thermo Fisher Scientific, diameter internal 300 μm, manik-manik 5 μm). Peptida dipisahkan pada kolom μPAC Neo™ 50 cm (Prototipe; Thermo Fisher Scientific), yang dijaga pada suhu konstan 50 °C. Peptida dielusi oleh gradien linier yang mencapai 4,5% pelarut MS B (0,1% asam format (FA) dalam asetonitril) setelah 7 menit, 17,5% pelarut MS B setelah 82 menit, 35% pelarut MS B pada 90 menit, dan 56% pelarut MS B setelah 100 menit, diikuti oleh pencucian 5 menit pada 56% pelarut MS B dan penyeimbangan ulang dengan pelarut MS A (0,1% FA dalam air). Selama 7 menit pertama, laju alir ditetapkan pada 500 nL·min −1 , setelah itu dijaga konstan pada 300 nL·min −1 .

Spektrometer massa dioperasikan dalam mode data-independen. Skema isolasi dibuat oleh perangkat lunak Skyline (Herndon, VA, AS) dengan  jendela  10 m/z antara 400 dan 900 m/z , dengan posisi jendela yang dioptimalkan. Spektrum MS2 direkam dengan resolusi 15.000, mengumpulkan 3.000.000 ion untuk maksimum 45 ms. Setelah 30 spektrum MS2, instrumen beralih kembali ke MS1 dengan resolusi 60.000 setelah mengumpulkan AGC 5.000.000 ion dengan waktu ion maksimum 50 ms dalam rentang pemindaian 375–1500  m/z .

2.3.4.3 Analisis data DIA-NN MS
Analisis data dilakukan dengan mesin pencari data-independent analysis (DIA)-neural network (NN) (v 1.9). Replikasi MIA PaCa-2 1 dihilangkan dari analisis karena variabilitasnya yang lebih tinggi dan kualitasnya yang lebih rendah daripada tiga replikasi lainnya dari garis sel tersebut (Tabel S2 dan Gambar S1 ). Pencarian bebas pustaka diaktifkan dan pustaka in silico baru dibuat berdasarkan proteom referensi manusia (UP000005640_9606, versi rilis 2024); fragmen m/z minimal dan maksimal ditetapkan masing-masing ke 200 dan 1800, dan kontaminan dihilangkan. Peptida dan Lib.PG.Qvalue difilter pada false discovery rate (FDR) sebesar 0,01. Pencernaan in silico ditetapkan sedemikian rupa sehingga memotong pada K* dan R* (* menunjukkan K dan R dapat diikuti oleh asam amino apa pun); hanya peptida dengan hingga dua belahan yang terlewat dan panjang antara 7 dan 30 asam amino yang diizinkan. Prekursor m/z minimal dan maksimal serta muatan ditetapkan masing-masing pada 400 dan 1800, 1 dan 4. Karbamidometilasi sistein diaktifkan sebagai modifikasi tetap, oksidasi (Metionin), dan asetilasi (protein N terminus) sebagai modifikasi variabel, dengan jumlah maksimum modifikasi variabel ditetapkan pada satu. Akurasi massa pada level MS2 ditetapkan pada 20 dan 10 ppm untuk MS1. Pencocokan antar pengujian diaktifkan dan pengklasifikasi jaringan saraf ditetapkan pada mode lintasan tunggal. Kami melanjutkan dengan kelimpahan kelompok protein PG.MaxLFQ. Output DIA-NN dijalankan melalui skrip R untuk menghasilkan file ProteinGroups.txt. Analisis data lebih lanjut dilakukan di perseus (v2.0.9.0).

2.3.4.4 Analisis diferensial dan analisis overrepresentasi
Analisis data diferensial dilakukan menggunakan perangkat lunak perseus (v2.0.9.0), intensitas protein ditransformasikan log 2 dan nilai yang hilang diimputasikan dengan nilai minimum. ANOVA serta perbandingan berpasangan dengan uji -t dua sampel (S0, FDR = 0,01, 1000 pengacakan) antara lini sel dilakukan (Tabel S3 ). Hit signifikan difilter untuk perubahan lipat Log 2 (FC) minimal dua. Protein yang diatur turun dan protein yang diatur naik dari perbandingan berpasangan secara terpisah dikenakan analisis overrepresentation yang dilakukan dengan WebGestalt 2024 ( https://www.webgestalt.org/ ) dengan basis data jalur gen ‘Reactome’. Set referensi yang digunakan adalah ‘pengkodean protein genom’. Hanya jalur dengan nilai- P yang disesuaikan dengan tingkat penemuan palsu < 0,05 yang dipertimbangkan (Tabel S4 ). Gambar yang sesuai divisualisasikan oleh prisma graphpad (San Diego, CA, AS).

2.4 Percobaan Parsortix®
2.4.1 Pelabelan sel
Labu T25 dari setiap lini sel diberi label awal dengan salah satu pewarna berikut: Pewarna CellTracker™ Blue CMAC (C2110; Invitrogen), Pewarna CellTracker™ Green CMFDA (C2925; Invitrogen), atau Pewarna CellTracker™ Deep Red (C34565; Invitrogen). Stok setiap pewarna dilarutkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO) sesuai dengan petunjuk pabrik. Sel-sel diwarnai pada tingkat konfluensi sekitar 70–80%. Sel-sel pertama-tama dicuci dengan PBS (14190094; Thermo Fisher Scientific) dengan pH antara 7,0 dan 7,3, diikuti oleh periode inkubasi dengan 4 mL larutan PBS/CellTracker™. Konsentrasi kerja CellTracker™ Blue adalah 30 μ m , dan waktu inkubasi adalah 30 menit (pada suhu 37 °C dan 5% CO 2 ); untuk CellTracker™ Green, adalah 6 μ m dan 30 menit (pada suhu 37 °C dan 5% CO 2 ); untuk CellTracker™ Deep Red, adalah 1 μ m dan 60 menit (pada suhu 37 °C dan 5% CO 2 ). Setelah inkubasi, reaksi dihentikan dengan menambahkan 5 mL medium kultur.

2.4.2 Eksperimen lonjakan
Sel yang dikultur dicuci dengan PBS dan dipisahkan dengan EDTA/Tripsin. Setelah sentrifugasi pada 194  g selama 10 menit, sel disuspensikan kembali dalam PBS hingga konsentrasi 10 sel·μL −1 . Penghitung Sel Otomatis LUNA-II™ (L40002-LG) digunakan untuk menghitung jumlah sel yang hidup dalam suspensi dan menentukan diameter rata-rata sel. Berikutnya, 10 μL (berisi rata-rata 100 sel) dari setiap jenis sel dimasukkan ke dalam tabung K2 EDTA (367525; BD) yang berisi 10 mL darah lengkap dari donor sehat. Setelah dimasukkan, tabung darah dibalik perlahan sedikitnya lima kali. Sebagai kontrol, suspensi sel 10 μL disemai dalam pelat dasar hitam/bening 96 sumur (165305; Sanbio BV, Uden, Belanda). Pelat 96 sumur diletakkan di bangku kerja selama minimal 1 jam, setelah itu jumlah sel dalam setiap sumur dihitung secara manual menggunakan Mikroskop Fluoresensi Kontras Fase Terbalik Zeiss Axio Observer Z1 (Jena, Jerman) dengan menggunakan lensa objektif Air 10x dan saluran DAPI, Fluorescein isothiocyanate (FITC) dan Allophycocyanin (APC).

Pemisahan darah dilakukan dengan perangkat Parsortix® menggunakan kaset dengan ukuran celah 6,5 μm dan tekanan pemisahan 99 mbar. Sel-sel yang terperangkap dalam kaset pemisahan dihitung secara manual menggunakan Mikroskop Fluoresensi Kontras Fase Zeiss Axio Observer Z1 menggunakan lensa objektif Air 20x dan saluran DAPI, FITC, dan APC. Laju pemulihan dihitung menurut persamaan di bawah ini:

2.4.3 Analisis statistik
Tingkat pemulihan dari percobaan yang direplikasi dilaporkan sebagai rata-rata ± simpangan baku (SD). Beberapa perbandingan antara tingkat pemulihan semua lini sel dilakukan dengan uji Friedman dengan koreksi Dunn. Analisis statistik dilakukan menggunakan prisma graphpad (versi 10.2.0) dan nilai P < 0,05 dianggap signifikan.

3 Hasil
3.1 Karakterisasi lini sel kanker pankreas
Menurut literatur, CAPAN-1 adalah garis sel epitel, sementara MIA PaCa-2 memiliki fenotipe mesenkimal yang ketat [ [ 19 , 20 ] ]. Sel PANC-1 digambarkan menampilkan sifat seperti epitel atau seperti mesenkimal tergantung pada uji pembacaan dan kondisi kultur [ [ 19 – 22 ] ]. Mengingat hasil garis sel PANC-1 yang saling bertentangan, kami melakukan karakterisasi menyeluruh dari ketiga garis sel menggunakan mikroskopi brightfield, ICC, flow cytometry, dan proteomik untuk menilai fenotipe epitel atau mesenkimal mereka sebelum melanjutkan dengan percobaan spike-in.

3.1.1 Morfologi sel
Ketiga lini sel tersebut berasal dari karsinoma pankreas; namun, morfologi mereka berbeda (Gbr. 1 ). EMT disertai dengan perubahan morfologi karena sel epitel lebih seperti batu bulat dengan polaritas apicobasal, sementara sel seperti mesenkimal memiliki bentuk spindel dengan polaritas depan-belakang. Dalam kondisi kultur adhesif 2D, sel CAPAN-1 menunjukkan morfologi massa, sel PANC-1 seperti anggur, dan sel MIA PaCa-2 menunjukkan dua morfologi yang berbeda: berbentuk bulat atau spindel [ [ 23 , 24 ] ]. Ini menunjukkan bahwa sel CAPAN-1 dan PANC-1 memiliki morfologi epitel, sementara sel MIA PaCA-2 memiliki morfologi yang lebih mesenkimal. Diameter sel rata-rata mereka dalam suspensi diukur sebelum setiap percobaan dengan LUNA-II Cell Counter. Rata-rata, sel CAPAN-1 berukuran 15,68 ± 0,44 μm (kisaran: 5–30 μm), sel PANC-1 berukuran 17,00 ± 1,59 μm (kisaran: 5–31 μm), dan sel MIA PaCa-2 berukuran 14,72 ± 0,50 μm (kisaran: 5–25 μm). Perbedaan ukuran antara lini sel ini tidak signifikan secara statistik ( P  = 0,0564, uji Kruskal–Wallis). Sebagai perbandingan, kaset pemisah Parsortix® memiliki ukuran celah 6,5 μm dan diameter CTC rata-rata bervariasi antara 7 dan 20 μm [ [ 25 – 27 ] ]. Oleh karena itu, ukuran lini sel tidak dianggap sebagai faktor yang akan berkontribusi terhadap perbedaan retensi sel dalam sistem Parsortix®.

Gbr. 1
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Informasi tentang lini sel kanker pankreas. (A) Mikroskopi Brightfield dari CAPAN-1 ( n  = 1), PANC-1 ( n  = 1), dan MIA PaCa-2 ( n  = 1). Skala batang = 200 μm. (B) Tabel dengan perbandingan subtipe kanker pankreas, morfologi, dan ukuran ( n  = 6), modulus kekakuan Young dari CAPAN-1, PANC-1, dan MIA PaCa-2 [ [ 44 , 49 ] ].
3.1.2 Penanda epitel/mesenkim
Sel epitel ditandai oleh sambungan antarsel, polaritas apikal-basal, dan interaksi dengan membran dasar [ [ 28 ] ]. Mereka mengekspresikan penanda seperti CDH1, EPCAM, dan Claudins [ [ 29 ] ]. Selama EMT, pergeseran ekspresi gen menekan sifat dan penanda epitel ini, dan karakteristik seperti mesenkim dipromosikan. Sel kemudian mengadopsi morfologi seperti fibroblas, mengalami perubahan struktural, dan memperoleh kemampuan migrasi dan sifat invasif [ [ 28 ] ]. Dalam keadaan seperti mesenkim, penanda seperti VIM, FN1, CDH2, dan CD44 diatur ke atas [ [ 29 ] ]. Sel dalam keadaan hibrida E/M mengekspresikan penanda dan sifat mesenkim dan epitel.

Awalnya, kami menentukan keadaan epitel dan/atau mesenkimal dari lini sel kanker pankreas dengan menilai ekspresi dua penanda yang banyak digunakan, CDH1 dan VIM, dengan ICC (Gbr. 2A ) [ [ 30 , 31 ] ]. Pada sel PANC-1 dan CAPAN-1, CDH1 terutama terdeteksi di sitoplasma, bukan di lokasi biasanya pada membran sel, yang menunjukkan bahwa protein tersebut tidak aktif [ [ 32 ] ]. Hal ini dikonfirmasi oleh flow cytometry, di mana CDH1 intraseluler dan CDH1 pada membran sel diukur (Gbr. 2B dan Gbr. S2 ). Secara intraseluler, sel CAPAN-1 dan, pada tingkat yang lebih rendah, sel PANC-1 positif untuk ekspresi CDH1, sementara ketiga lini sel tidak memiliki atau memiliki CDH1 rendah pada membran selnya.

Gambar 2
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Analisis fenotipe epitel/mesenkimal dari lini sel kanker pankreas. (A) Ekspresi CDH1 dan VIM dievaluasi dengan pewarnaan imunofluoresens pada sel CAPAN-1 ( n  = 1), PANC-1 ( n  = 1), dan MIA PaCa-2 ( n  = 1). DAPI digunakan sebagai pewarna nuklir. Skala batang: 100 μm. (B) Ekspresi EPCAM, CDH1 intraseluler, CD44, VIM, CDH2, dan ZEB1 dianalisis dengan flow cytometry.
Karena menyimpulkan fenotipe epitel atau mesenkimal tidak boleh terjadi hanya berdasarkan VIM dan CDH1 [ [ 28 ] ], penanda EMT tambahan disertakan dalam analisis flow cytometry (Gbr. 2B ). Data proteomik dari tiga lini sel digunakan untuk mengevaluasi panel penanda E/M yang lebih luas (Gbr. 3 ). Selain itu, eksperimen ICC tambahan dilakukan untuk pan-CK, EPCAM, CLDN4, FN1, CDH2, dan CD44 (Gbr. S3–S6 ). Perbandingan hasil dapat ditemukan di Tabel 1 . Kami menemukan beberapa perbedaan antara data imunopewarnaan, flow cytometry, dan proteomik. Data flow cytometry dan proteomik mengonfirmasi kurangnya ekspresi VIM dalam sel CAPAN-1, seperti yang diamati dengan imunopewarnaan, namun menunjukkan bahwa kadar VIM dalam sel PANC-1 dan MIA PaCa-2 sebanding (Gbr. 2B dan 3B ). Lebih jauh lagi, protein mesenchymal CDH2 ditemukan dalam data proteomik sel CAPAN-1 dan PANC-1 (Gbr. S5 ), sementara dalam data flow cytometry, ditemukan dalam sel MIA PaCa-2 dan PANC-1, yang lebih sesuai dengan apa yang diharapkan. Flow cytometry mendeteksi hanya CDH2 aktif yang ada pada membran sel. Sebaliknya, pewarnaan ICC untuk CDH2 menunjukkan ekspresi dalam sel CAPAN-1 tetapi tidak dalam sel PANC-1 atau MIA PaCa-2. FN1 adalah penanda mesenchymal tetapi terdeteksi dalam sel CAPAN-1 dan pada tingkat yang lebih rendah dalam sel MIA PaCa-2, dan tidak dalam sel PANC-1 dengan ICC dan proteomik (Gbr. S3 ). Penanda mesenchymal CD44 terdeteksi di semua lini sel dengan ICC, tetapi dengan flow cytometry dan proteomik hanya di sel PANC-1 dan MIA PaCa-2 (Gbr. S6 ). Terakhir, faktor transkripsi terkait EMT ZEB1 dideteksi melalui flow cytometry terutama pada sel MIA PaCa-2, tetapi tidak melalui analisis proteom.

Gambar 3
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Data proteomik dari lini sel kanker pankreas CAPAN-1 ( n  = 4), PANC-1 ( n  = 4) dan MIA PaCa-2 ( n = 3). Intensitas protein dari (A) penanda epitel CDH1 dan (B) penanda mesenkimal VIM tanpa transformasi log 2 dan tanpa nilai imputasi; sebagai gantinya, nilai yang hilang diganti dengan nol. Batang galat mewakili SD. (C) Peta panas penanda epitel dan mesenkimal yang ditemukan dalam data proteomik. Nilai ditransformasikan log 2 dan nilai yang hilang diimputasi dari distribusi normal di sekitar batas deteksi, dan nilai sel mewakili intensitas yang dinormalisasi melalui skor Z. Sel darah merah menunjukkan skor Z yang tinggi , sel biru menunjukkan skor Z yang rendah .
Tabel 1. Tinjauan umum penanda EMT dalam lini sel kanker pankreas: CAPAN-1, PANC-1, dan MIA PaCa-2. −: tidak ditemukan, tidak ada sinyal; −/+: sedikit atau tidak ada sinyal; +: ada dalam sel; ++: ekspresi tinggi; /: tidak disertakan dalam pengaturan eksperimen. Aliran, flow cytometry; ICC, imunositokimia; MS, proteomik.

Berdasarkan penanda molekuler beserta morfologinya, kami menyimpulkan bahwa sel CAPAN-1 menunjukkan fenotipe epitel, sel MIA PaCa-2 mirip sel mesenkim, dan sel PANC-1 berada dalam transisi antara kedua keadaan tersebut, yang menunjukkan fenotipe hibrida E/M. Oleh karena itu, ketiga lini sel pankreas ini tampaknya mewakili berbagai subtipe CTC yang ditemukan pada pasien kanker pankreas.

3.2 Karakterisasi model EMT yang dapat diinduksi: garis sel MCF7 iZEB1
Sel MCF7 iZEB1 diobati dengan DOX selama 72 jam, diikuti oleh qRT-PCR untuk menganalisis ekspresi ZEB1 dan beberapa penanda EMT. Perlakuan DOX menginduksi ekspresi ZEB1 pada tingkat mRNA, mengurangi kadar RNA penanda epitel CDH1 , CLDN4 , dan Occludin ( OCLN ), dan meningkatkan penanda mesenkimal CD44 , VIM , dan FN1 (lihat Gambar 4A ). Imunositokimia kemudian dilakukan pada sel yang diobati dengan DOX untuk mengonfirmasi temuan ini pada tingkat protein. Ekspresi ZEB1 diamati pada sel yang diobati dengan DOX, tanpa ekspresi bocor yang terdeteksi pada sel yang tidak diinduksi. Hal ini disertai dengan hilangnya CDH1 pada membran plasma dan peningkatan kadar vimentin (lihat Gambar 4B ), yang membuktikan bahwa sel menjalani EMT setelah pengobatan DOX.

Gambar 4
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Analisis fenotip epitel/mesenkimal sel MCF7 iZEB1 setelah 72 jam induksi DOX. (A) Nilai log 2 (FC) tingkat ekspresi mRNA ZEB1, epitel (CDH1, CLDN4, OCLN), dan penanda mesenkimal (CD44, VIM, FN1) pada sel MCF7 iZEB1 yang diinduksi doksisiklin (DOX) ( n  = 3) versus sel MCF7 iZEB1 yang tidak diinduksi ( n  = 3). Perbandingan berganda antara penanda pada kelompok −DOX dan +DOX dengan uji ANOVA dengan koreksi Šídák dilakukan (**** P  < 0,001). Batang galat menunjukkan SD. (B) Ekspresi ZEB1, CDH1, dan VIM dievaluasi dengan pewarnaan imunofluoresens pada sel MCF7 iZEB ( n  = 3). DAPI (biru) digunakan sebagai pewarna nuklir. Skala batang: 50 μm.
3.3 Percobaan Parsortix®
Kemampuan sistem Parsortix® untuk memperkaya sel kanker epitel, mesenkimal, dan hibrida pankreas dievaluasi melalui eksperimen spike-in menggunakan tiga lini sel kanker pankreas. Sekitar 100 sel dari setiap lini sel di-spike ke dalam 10 mL darah donor sehat, dan laju pemulihan lini sel individual dihitung (lihat Gambar 5A ). Jumlah sumur kontrol dan perhitungan laju pemulihan dapat ditemukan di Tabel S5 . Sel PANC-1 dan CAPAN-1 ditemukan memiliki rasio pemulihan sekitar dua kali lipat lebih tinggi daripada sel MIA PaCa-2 (laju pemulihan rata-rata ± SD; CAPAN-1: 62,6 ± 18,5%, PANC-1: 65,4 ± 11,1%, dan MIA PaCa-2: 32,8 ± 10,2%). Hasil-hasil ini menunjukkan bahwa sel tumor pankreas mesenkimal (MIA PaCa-2) kurang diperkaya secara efektif oleh sistem Parsortix® dibandingkan dengan sel epitel atau hibrida (CAPAN-1 dan PANC-1).

Gambar 5
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Tingkat pemulihan sistem Parsortix® (A) untuk lini sel kanker pankreas: CAPAN-1: 62,6 ± 18,5% ( n  = 6), PANC-1: 65,4 ± 11,1% ( n  = 6), dan MIA PaCa-2: 32,8 ± 10,2% ( n  = 6). Perbandingan berganda antara semua lini sel dengan uji Friedman dengan koreksi Dunn dilakukan (** P  < 0,01) (B) untuk sel MCF7 iZEB1 yang diobati dengan doksisiklin (fenotipe mesenkimal) dan tanpa doksisiklin (fenotipe epitel); Epitel ( n  = 5): 47,56 ± 7,2% dan mesenkimal ( n  = 7): 31,5 ± 6,4%. Uji Mann–Whitney antar kelompok (* P  < 0,05). Batang galat menunjukkan SD.
Bahasa Indonesia: Untuk mengesampingkan bahwa perbedaan dalam tingkat pemulihan pada percobaan sebelumnya dapat disebabkan oleh perbedaan deformabilitas inheren antara lini sel pankreas, percobaan Parsortix® diulang menggunakan model seluler MCF7 iZEB1 EMT. Percobaan spike-in dilakukan menggunakan sel MCF7 iZEB1 dalam keadaan epitel dan seperti mesenkimal (diinduksi DOX). Sekali lagi, kami menemukan bahwa sel dengan fenotipe seperti mesenkimal memiliki tingkat pemulihan yang secara signifikan lebih rendah (lihat Gambar 5B dan Tabel S5 ): Sel MCF7 iZEB1 dalam keadaan epitel memiliki tingkat pemulihan 47,56 ± 7,2%, sedangkan sel MCF7 iZEB1 dalam keadaan seperti mesenkimal memiliki tingkat pemulihan 31,5 ± 6,4%. Sel MCF7 iZEB1 tidak berbeda secara signifikan dalam ukuran; sel epitel, rata-rata, dalam suspensi berukuran 16,81 ± 1,1 μm dan sel mirip mesenkim berukuran 16,14 ± 0,6 μm. Jadi, satu-satunya perbedaan antara kedua kelompok di sini adalah status EMT. Oleh karena itu, percobaan ini mengonfirmasi bahwa lebih sedikit sel kanker mirip mesenkim yang tertahan selama pengayaan dengan sistem Parsortix® dibandingkan dengan sel kanker epitel.

4 Diskusi
4.1 Karakterisasi lini sel kanker pankreas
Kami mulai dengan mengkarakterisasi secara menyeluruh ketiga lini sel pankreas untuk menilai fenotipe epitel atau mesenkimalnya. Ada beberapa perbedaan antara data imunopewarnaan, flow cytometry, dan proteomik. Perbedaan dalam lokalisasi protein, modifikasi pascatranslasi, dan sensitivitas deteksi di seluruh teknik dapat berkontribusi pada variasi ini. Proteomik mengukur kadar protein total, termasuk bentuk intraseluler dan tidak aktif, yang mungkin tidak selalu berkorelasi dengan ekspresi protein fungsional. Sebaliknya, imunositokimia dan flow cytometry bergantung pada spesifisitas antibodi dan kondisi pewarnaan, yang terkadang dapat menyebabkan hasil yang tidak konsisten. Antibodi yang digunakan dalam pewarnaan ICC untuk CDH2 tidak memiliki spesifisitas (Gbr. S3 ), membuat hasil ini kurang dapat diandalkan. Selain itu, EMT adalah proses yang dinamis dan bergantung pada konteks, dengan sel-sel yang ada di sepanjang spektrum daripada dalam keadaan epitel atau mesenkimal yang jelas berbeda. Heterogenitas dalam populasi sel, keberadaan fenotipe hibrida E/M, dan variasi dalam kondisi eksperimen semakin mempersulit klasifikasi fenotipe. Hal ini menyoroti kompleksitas dalam mendefinisikan status EMT sel kanker dan menggarisbawahi tantangan yang terkait dengan penggunaan metode deteksi tunggal untuk mengklasifikasikan fenotipe epitel atau mesenkimal.

Perhatikan bahwa kategorisasi kami terhadap garis sel PANC-1 bertentangan dengan beberapa penelitian lain, yang seringkali hanya berdasarkan pada ekspresi CDH1 dan VIM yang dievaluasi dengan western blot atau ekspresi CDH1 pada membran sel [ [ 19 , 20 ] ]. Ungefroren dkk. [ [ 22 ] ] menyarankan bahwa kultur sel PANC-1 dapat secara bersamaan mengandung sel-sel epitel dan seperti mesenkim, dan sel-sel dalam transisi. Imunostaining kami memang mengungkapkan bahwa beberapa sel PANC-1 hanya mengekspresikan CDH1 dan yang lainnya hanya VIM; namun, mayoritas sel PANC-1 positif untuk kedua penanda (Gbr. 1A ).

4.2 Eksperimen Parsortix® dan deformabilitas
Percobaan spike-in kami menunjukkan bahwa sistem Parsortix® memperkaya sel kanker epitel dan hibrida E/M lebih efisien daripada sel kanker mirip mesenkimal. Tren ini diamati pada lini sel kanker pankreas dan model yang dapat diinduksi EMT. Hvichia dkk. [ [ 33 ] ] mengamati tren serupa dalam percobaan spike-in mereka dengan sistem Parsortix®. Mereka mengevaluasi lima lini sel dari berbagai jenis kanker: sel PANC-1, A375, PC3, A549, dan T24. Semuanya memiliki tingkat pemulihan yang serupa antara 60% dan 70%, kecuali sel T24, yang memiliki tingkat pemulihan rata-rata 42%. Para penulis awalnya menghubungkan perbedaan ini dengan ukuran sel; namun, semua sel rata-rata lebih besar dari celah 10 μm kaset pemisah Parsortix®. Namun, perbedaan dalam tingkat pemulihan sel juga dapat dikaitkan dengan fenotipe E/M mereka karena hal ini mungkin terkait dengan deformabilitasnya [ [ 17 ] ]. Literatur menggambarkan garis sel dengan tingkat pemulihan yang lebih tinggi memiliki fenotipe epitel atau hibrida E/M, sedangkan sel T24 dicirikan oleh fenotipe seperti mesenkimal [ [ 34 – 37 ] ]. Hal ini sesuai dengan temuan kami dan menunjukkan bahwa sistem Parsortix®, seperti sistem CellSearch®, tampaknya bias terhadap sel kanker epitel dan hibrida E/M.

Secara keseluruhan, sel kanker epitel memiliki jaringan sitoskeletal yang sangat terstruktur dan kaku yang sering kali tidak sesuai dengan deformabilitas sel, sementara sel kanker mesenkimal memperoleh sifat sitoskeleton yang dinamis dan lebih dapat dideformasi, yang mendukung keberhasilan metastasis [ [ 38 – 41 ] ]. Bagnall dkk. [ [ 39 ] ] membuktikan bahwa sel kanker mesenkimal lebih dapat dideformasi dan melewati mikrokanal lebih cepat dibandingkan dengan sel tumor epitel. Karena sistem Parsortix® memperkaya CTC berdasarkan ukuran dan deformabilitas, masuk akal jika sel mesenkimal, yang seringkali lebih dapat dideformasi, kurang efisien dipertahankan [ [ 33 ] ]. Karena sel MIA PaCa-2 memiliki tingkat pemulihan yang lebih rendah daripada sel CAPAN-1 dan PANC-1, kami menduga jalur yang terkait dengan deformabilitas mengalami penurunan regulasi pada sel-sel ini. Oleh karena itu, protein yang diekspresikan secara diferensial dari data MS dianotasi secara fungsional melalui analisis kelebihan representasi jalur REACTOME (Gbr. S7 ). Tumpang tindih ditemukan dalam jalur yang secara signifikan kurang terwakili dalam sel MIA PaCa-2 dibandingkan dengan sel PANC-1 dan CAPAN-1, seperti ‘siklus Rho GTPase’. Jalur ini mengatur sitoskeleton aktin dan memengaruhi migrasi sel, adhesi sel, pembelahan sel, dan membentuk polaritas sel. Jalur RhoA adalah jalur yang paling terkenal dalam kelompok ini, yang bertanggung jawab atas kontraktilitas sel [ [ 42 ] ]. RhoA mengaktifkan Rho-associated protein kinase (ROCK), yang mengarah pada aktivasi protein hilir seperti myosin II, yang pada akhirnya mengarah pada peningkatan kontraktilitas sel, kekakuan sitoskeletal dan modulus kekakuan Young, dan dengan demikian penurunan deformabilitas sel. Peningkatan kontraktilitas ini pada sel PANC-1 dibandingkan dengan sel MIA PaCa-2 dapat menjelaskan perbedaan dalam tingkat pemulihan dengan sistem Parsortix®.

Dalam kanker payudara, korelasi yang terbukti ada antara deformabilitas CTC dan tingkat keparahan kanker [ [ 43 ] ]. Semakin tinggi grade dan stadium kanker, semakin tinggi deformabilitas CTC. Namun, ada juga bukti yang menunjukkan sebaliknya, yang menyatakan bahwa sel kanker payudara yang lebih kaku lebih invasif. Nguyen et al. [ [ 44 ] ] menyarankan bahwa hubungan antara kekakuan sel kanker dan potensi invasifnya mungkin bergantung pada jenis kanker. Sementara banyak penelitian mengidentifikasi sel kanker payudara dan ovarium yang lebih dapat dideformasi sebagai lebih invasif, sel kanker paru-paru dan kanker pankreas yang lebih kaku memiliki potensi invasif yang lebih besar. Misalnya, ada bukti yang menunjukkan bahwa sel PANC-1, meskipun memiliki modulus Young yang lebih tinggi, sedikit lebih invasif daripada sel MIA PaCa-2 [ [ 44 ] ]. Modulus Young yang lebih tinggi pada sel PANC-1 menjelaskan tingkat pemulihan yang lebih tinggi dengan sistem Parsortix®. Namun, apakah sel tersebut lebih invasif atau tidak, perlu diingat bahwa saat menggunakan sistem Parsortix®, sebagian populasi CTC mesenkimal yang dapat dideformasi hilang selama pengayaan.

Nitschke et al. [ [ 45 ] ] menganalisis 19 sampel darah dari pasien kanker pankreas paliatif dengan sistem Parsortix® dan mendeteksi CTC hanya pada 26,3% pasien, dengan rata-rata 3,6 CTC per 7,5 mL darah. Sebaliknya, Zhu et al. [ [ 46 ] ] menganalisis 40 pasien dengan kanker pankreas stadium I hingga IV dengan gradien densitas dan penipisan CD45 dan menemukan CTC pada 75% pasien, dengan rata-rata 33 CTC per 7 mL darah. Jadi, tampaknya metode pengayaan lainnya, seperti penipisan sel imun, menghasilkan tingkat pemulihan yang lebih tinggi, mungkin menjadikannya pilihan yang lebih baik untuk mempelajari CTC kanker pankreas.

4.3 Keterbatasan penelitian
Orang perlu mengingat bahwa fenotipe sel epitel atau mesenkimal tidak ‘terkunci’ dan sel, bahkan dalam kultur, dapat beralih dari satu keadaan ke keadaan lain atau berada dalam transisi antara keadaan ini [ [ 28 ] ]. Kami menentukan fenotipe sel yang tumbuh dalam kondisi kultur 2D dan dengan demikian dimungkinkan bahwa dalam lingkungan yang berbeda, sel dapat beralih ke fenotipe lain. Dalam hal ini, idealnya, keadaan epitel/mesenkimal juga harus dinilai melalui kombinasi sifat seluler, seperti kapasitas invasif dan migrasi mereka selain beberapa penanda molekuler [ [ 28 ] ]. Namun, karena sampel darah segera diproses setelah spike-in, kami berharap bahwa sel memiliki waktu terbatas untuk menjalani perubahan signifikan dalam keadaan EMT mereka.

Variabilitas dalam tingkat pemulihan antar percobaan diamati, yang sebagian dapat dijelaskan oleh prosedur spike-in yang tidak tepat, penghitungan sel secara manual dalam kaset pemisah, dan variasi dalam ukuran sel dalam kultur. Namun, kami menduga sebagian besar variabilitas ini mungkin melekat pada perangkat Parsortix® itu sendiri. Untuk penghitungan longitudinal CTC dalam sampel darah selama perawatan pasien, sistem pengayaan yang kuat sangat penting. Untuk menilai secara akurat variabilitas yang diperkenalkan oleh perangkat Parsortix® dan teknik pengayaan CTC lainnya, proses spike-in harus dioptimalkan untuk meminimalkan perbedaan antara jumlah sel spike yang sebenarnya dan yang diharapkan. Standarisasi langkah ini akan memungkinkan evaluasi yang lebih tepat terhadap konsistensi dan kinerja perangkat.

Penggunaan sel yang telah diwarnai sebelumnya untuk deteksi tidak sepenuhnya memperhitungkan heterogenitas CTC yang sebenarnya yang diamati pada pasien. Berbagai lini sel ditambahkan ke satu sampel darah untuk meniru subtipe CTC dalam sampel pasien. Meskipun demikian, kurangnya klaster CTC dan interaksi dengan sel imun membuat sampel kami kurang sebanding dengan sampel pasien. Akibatnya, kinerja sistem Parsortix® mungkin berbeda antara sampel yang disimulasikan dengan sampel klinis yang sebenarnya. Namun, kami berasumsi bahwa pada kenyataannya, tingkat pemulihan CTC akan lebih rendah, karena sel kanker yang digunakan di sini rata-rata berukuran lebih besar dan telah diwarnai sebelumnya, sehingga lebih mudah dilacak dalam kaset pemisah.

Dengan sistem Parsortix®, juga memungkinkan untuk menggunakan sampel darah tetap (misalnya, tabung Transfix® atau CellSave®), sementara kami berfokus pada tabung darah EDTA. Dengan cara ini, sel darah dan akibatnya CTC menjadi tetap dan kurang dapat dideformasi, sehingga meningkatkan tingkat pemulihan [ [ 47 ] ]. Kelemahan metode ini adalah pembatasan besar untuk analisis hilir karena sel-sel tidak lagi layak, yang mengecualikan ekspansi CTC dalam kultur sel dan membuat pengurutan RNA dan spektrometri massa lebih menantang. Namun, jika fokus utamanya adalah penghitungan CTC, mungkin direkomendasikan untuk menggunakan sampel darah tetap, namun CTC dapat memberikan informasi lebih lanjut tentang stadium penyakit dan heterogenitas tumor jika dianalisis lebih luas setelah pengayaan.

5 Kesimpulan
Dalam studi ini, fenotip E/M dari tiga lini sel kanker pankreas, CAPAN-1, PANC-1, dan MIA PaCa-2, dikarakterisasi secara ekstensif dengan ICC, flow cytometry, dan proteomik. Sel CAPAN-1 ditemukan sebagai sel epitel, sel MIA PaCa-2 seperti sel mesenkim, dan sel PANC-1 hibrida E/M. Tujuan utamanya adalah untuk menilai efektivitas sistem Parsortix® dalam memperkaya sel kanker ini, dengan memanfaatkan sampel darah lengkap yang dicampur dengan lini sel kanker pankreas yang mewakili populasi CTC yang heterogen. Hasil spike-in menunjukkan bahwa sementara fenotip epitel dan hibrida E/M ditangkap secara efisien (62,6 ± 18,5% dan 65,4 ± 11,1%) dengan sistem Parsortix®, sel kanker seperti sel mesenkim menunjukkan tingkat pemulihan yang lebih rendah (32,8 ± 10,2%), kemungkinan karena peningkatan deformabilitasnya. Temuan ini dikonfirmasi dengan lini sel kanker payudara yang dapat diinduksi EMT: tingkat pemulihan yang jauh lebih rendah ditemukan untuk sel MCF7 dalam keadaan seperti mesenkimal dibandingkan dengan sel dalam keadaan epitel. Hal ini menunjukkan bahwa keadaan E/M sel memengaruhi efisiensi pengayaannya oleh sistem Parsortix®.

Dengan demikian, meskipun sistem Parsortix® mengatasi beberapa keterbatasan metode lain, temuan kami menunjukkan bahwa sistem ini cenderung meremehkan jumlah total sel kanker yang bersirkulasi dan lebih efisien dalam memperkaya fenotipe epitel dan hibrida E/M daripada sel mirip mesenkim. Penelitian di masa mendatang harus difokuskan pada penyempurnaan teknologi untuk meminimalkan kehilangan CTC dan untuk sepenuhnya menangkap heterogenitas populasi CTC, yang penting untuk menerjemahkan temuan ini ke dalam praktik klinis.