Abstrak
Kegagalan relatif inhibitor titik pemeriksaan imun pada adenokarsinoma duktal pankreas (PDAC) meskipun memiliki lingkungan mikro tumor imunosupresif yang padat menyoroti kebutuhan untuk menargetkan jalur alternatif/pelarian. Kami sebelumnya telah memeriksa reseptor kemokin C–C tipe 9 (CCR9) sebagai kandidat titik pemeriksaan imun dan mengembangkan antibodi monoklonal humanisasi yang ditargetkan (SRB2). Sitotoksisitas SRB2 dievaluasi secara in vitro dan in vivo . Ekspresi CCR9 pada sel/jaringan PDAC, komponen imun organoid yang berasal dari pasien (PDO), dan sitotoksisitas yang dimediasi sel yang bergantung pada antibodi diperiksa. Pada lini sel PANC-1 dan MIA PaCa-2, kami menunjukkan ekspresi CCR9 tertinggi; namun, tidak ada efek sitotoksik langsung yang diamati dengan pengobatan SRB2. Pada sel PANC-1, sitotoksisitas yang dimediasi sel NK dipromosikan oleh SRB2. Sitotoksisitas SRB2 yang bergantung dosis diamati pada PDO PDAC. Pada model tikus xenograft yang berasal dari pasien, sitotoksisitas monoterapi SRB2 dan dalam kombinasi dengan oxaliplatin juga ditunjukkan. Pada model tikus imunokompeten yang dimanusiakan, kemanjuran SRB2 serupa dengan obat lain, tetapi dua tikus dalam kelompok ini mengalami regresi tumor lengkap. Studi kami saat ini menunjukkan bahwa penargetan terapeutik CCR9 dapat meningkatkan hasil PDAC, dan studi tambahan sedang dilakukan untuk mengevaluasi SRB2 untuk penggunaan klinis.
Singkatan
ADCC
sitotoksisitas seluler yang bergantung pada antibodi
ATCC
Koleksi Budaya Tipe Amerika
BME
ekstrak membran dasar
CCL25
ligan kemokin 25
Bahasa Indonesia: CCR9
Reseptor kemokin C–C tipe 9
DNA
DNA komplementer
FBS
serum janin sapi
GAPDH
gliseraldehida-3-fosfat dehidrogenase
GEPIA
Analisis Interaktif Profil Ekspresi Gen
GPCR
Reseptor berpasangan protein G
GTEx
Genotipe-Ekspresi Jaringan
DIA
hematoksilin dan eosin
SDM
peroksidase lobak
ICI
penghambat titik pemeriksaan kekebalan
JIKA
Imunofluoresensi
IgG1
imunoglobulin G1
Posyandu
imunohistokimia
Saya
onkologi imun
Bahasa Inggris
antibodi monoklonal
NCG
NOD-Prkdc em26Cd52 Il2rgem 26Cd22 /NjuCrl
NK
pembunuh alami
Bahasa Indonesia: PBS
garam penyangga fosfat
PCR
reaksi berantai polimerase
PD1
protein kematian sel terprogram 1
PDAC
kanker pankreas
PDL1
Ligand kematian sel terprogram 1
PDO
organoid yang berasal dari pasien
PDX
xenograft yang berasal dari pasien
qPCR
reaksi berantai polimerase kuantitatif waktu nyata
SD
simpangan baku
SEJARAH
kesalahan standar rata-rata
TCGA
Atlas Genom Kanker
Waktu
lingkungan mikro tumor
Bahasa Indonesia: V
volume
1 Pendahuluan
Kanker duktus pankreas memiliki lingkungan mikro tumor stroma padat (TME) yang meningkatkan pertumbuhan tumor, kelangsungan hidup, dan penghindaran imun. Terapi onkologi imun (IO) seperti inhibitor titik pemeriksaan imun (ICIs) menargetkan jalur penghindaran imun di TME untuk meningkatkan sitotoksisitas yang dimediasi sel-T [ [ 1 ] ]. Obat-obatan IO, seperti anti-programed cell death protein 1 (PD1) atau obat anti-programed cell death ligand 1 (PDL1), disetujui dalam berbagai jenis kanker (misalnya, kanker ginjal, hati, kandung kemih, dan paru-paru) [ [ 2 ] ], namun obat-obatan tersebut gagal mengubah lanskap terapi untuk pasien dengan adenokarsinoma duktal pankreas (PDAC) [ [ 3 ] ]. Dalam upaya kami untuk lebih memahami cara meningkatkan penargetan TME PDAC dengan agen IO, kami mengidentifikasi reseptor kemokin C–C tipe 9 (CCR9) sebagai kandidat titik pemeriksaan imun. Di sini, kami menguji kemanjuran terapi SRB2, antibodi monoklonal (mAb) imunoglobulin G1 (IgG1) humanisasi dengan Fc dioptimalkan yang memicu peningkatan sitotoksisitas yang dimediasi sel bergantung antibodi (ADCC), yang dikembangkan untuk menargetkan CCR9.
CCR9 adalah reseptor berpasangan protein-G (GPCR) yang bertanggung jawab untuk perkembangan dan pematangan sel T. Sumbu reseptor-ligan kemokin CCR9/chemokine ligand 25 (CCL25) tidak hanya bertanggung jawab untuk perkembangan sel T dan perekrutan sel imun, tetapi juga tampaknya mendukung fenotipe invasif tumor padat [ [ 4 – 6 ] ]. Faktanya, kelompok kami sebelumnya menyelidiki CCR9, menunjukkan tingkat ekspresinya yang tinggi dalam jaringan PDAC dan regulasinya terhadap pertumbuhan dan proliferasi PDAC [ [ 5 ] ]. Khususnya, kami menemukan bahwa ligan CCL25 disekresikan oleh sel stellata pankreas di TME PDAC, yang menunjukkan jalur pensinyalan parakrin pro-survival dan anti-imun [ [ 5 ] ]. Baru-baru ini, kami mengkarakterisasi pensinyalan yang dimediasi CCR9 baru yang mempromosikan perkembangan PDAC melalui aktivasi β-catenin [ [ 7 ] ].
Karena peran CCR9 dalam mengatur perkembangan sel T dan mempromosikan invasi PDAC, kami berhipotesis bahwa CCR9 berfungsi sebagai titik pemeriksaan imun yang melemahkan sel T dan memfasilitasi penghindaran kematian sel kanker yang dimediasi imun. Untuk mengeksplorasi antagonisme terapeutik CCR9 dan pencalonannya sebagai titik pemeriksaan imun, kami menguji aktivitas terapeutik dari mAb terapeutik anti-CCR9 baru SRB2 (SunRock Biopharma, Spanyol) secara in vitro dan in vivo . mAb ini memiliki afinitas pengikatan yang tinggi terhadap CCR9 dan telah menunjukkan ADCC yang kuat melalui sel pembunuh alami (NK) secara in vivo [ [ 8 ] ]. Kami berhipotesis bahwa menargetkan CCR9 dengan SRB2 mungkin merupakan pendekatan terapeutik baru untuk pasien dengan PDAC.
2 Bahan dan Metode
2.1 Kultur sel
Garis sel PDAC yang telah ditetapkan AsPC-1 ( RRID: CVCL_0152 ), CaPan-2 ( RRID: CVCL_0026 ), MIAPaCa-2 ( RRID: CVCL_0428 ), dan PANC-1 ( RRID: CVCL_0480 ) diperoleh dari American Type Culture Collection (ATCC). Identitas garis sel ini diverifikasi menggunakan basis data ExPASy Cellosaurus. Semua garis sel diautentikasi dalam 3 tahun terakhir melalui profil pengulangan tandem pendek. Selain itu, semua garis sel secara rutin diuji untuk kontaminasi Mycoplasma menggunakan uji berbasis reaksi berantai polimerase (PCR), dan hanya sel bebas Mycoplasma yang digunakan untuk percobaan. Untuk meminimalkan pergeseran genetik, semua percobaan dilakukan menggunakan sel-sel yang mengalami peralihan awal (yaitu, < P 10). Mengingat waktu yang berlalu antara penerimaan sel P0 dari ATCC, perbankan sel, dan penggunaan selanjutnya, kami selanjutnya memvalidasi integritas genom garis sel kami melalui ATCC untuk mengonfirmasi identitasnya dan memastikan keandalan.
Sel MIAPaCa-2 dan PANC-1 dikultur dalam Dulbecco’s Modified Eagle Medium (Gibco) yang dilengkapi dengan 10% fetal bovine serum (FBS), 1% Penicillin–Streptomycin (10.000 IU/mL), dan 1% L-glutamine (200 mM) (Thermo Fisher, Waltham, MA, AS). Media RPMI 1640 (Gibco, Waltham, MA, AS) yang dilengkapi dengan 10% FBS digunakan untuk sel AsPC-1. Media McCoy’s 5A (ATCC, Manassass, VA, AS) yang dilengkapi dengan 10% FBS digunakan untuk sel Capan-2. Semua lini sel dipertahankan pada suhu 37 °C dalam atmosfer humidifikasi pada 5% CO 2 . Lini sel dilewatkan setiap 3–4 hari pada konfluensi 70–80%.
2.2 Pengembangan organoid yang berasal dari pasien
Organoid yang berasal dari pasien (PDO) dibuat seperti yang dijelaskan sebelumnya [ [ 9 ] ]. Secara singkat, jaringan PDAC dicincang, dicerna, dan dicuci. Pelet sel disuspensikan kembali dalam ekstrak membran dasar faktor pertumbuhan tereduksi (BME; Trevigen, Minneapolis, MN, AS) dan dikultur dalam medium PDO lengkap yang dilengkapi dengan Y27632 (10 μM). Medium kultur diganti setiap 2–3 hari, dan PDO dilewatkan setiap 5–7 hari saat konfluensi 70–80%.
2.3 Pengembangan sel tunggal PDO untuk pengujian obat
Setelah pertumbuhan dan pengoperan, PDO dipisahkan menjadi sel tunggal untuk pengujian obat menggunakan metodologi yang dijelaskan sebelumnya [ [ 9 , 10 ] ]. Singkatnya, PDO dipisahkan menjadi sel tunggal dan ditanam dalam pelat 96-sumur pada 2000–5000 sel/10 μL/sumur dalam 50% BME. Setelah sekitar 3 hari, setelah sel tunggal PDO membentuk PDO kecil, pengujian obat dimulai.
2.4 Ekstraksi RNA, transkripsi balik, dan PCR kuantitatif waktu nyata
Sel dan jaringan PDAC dihomogenkan dengan larutan penyangga fosfat dingin (PBS) dan disentrifugasi untuk pengumpulan. Pelet sel atau jaringan disimpan pada suhu -80 °C sebelum ekstraksi RNA. Total RNA diekstraksi menggunakan RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, Germantown, MD, AS). Transkripsi balik dilakukan menggunakan Kit DNA komplementer (cDNA) (Applied Biosystems) pada C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad). PCR kuantitatif waktu nyata (qPCR) dilakukan pada Mesin PCR Waktu Nyata QuantStudio 3 (Applied Biosystems) menggunakan kondisi siklus termal standar: 50 °C selama 2 menit, 95 °C selama 10 menit, diikuti oleh 40 siklus 95 °C selama 15 detik dan 60 °C selama 1 menit. Primer human glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) dan CCR9 disintesis (Integrated DNA Technologies) dengan urutan berikut: GAPDH (102 bp), forward 5′-CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG-3′ dan reverse 5′-CTACATGGCAACTGTGAGGAG-3′; dan CCR9 (166 bp), forward 5′-ACACCCACAGACTTCACAAG-3′ dan reverse 5′-AGCCAGTACAAGGGTGGGA-′ Semua uji PCR dijalankan dalam duplikasi dan untuk setidaknya 2 eksperimen independen. Nilai C t digambarkan untuk menunjukkan tingkat ekspresi relatif di seluruh sampel.
2.5 Uji Western blot
Uji western blot dilakukan untuk mengevaluasi ekspresi protein CCR9 dalam sel PDAC dan PDO seperti yang dijelaskan [ [ 11 ] ]. Blot diinkubasi semalaman pada suhu 4 °C dengan antibodi primer kelinci terhadap CCR9 (1 : 1000, Invitrogen) atau antibodi primer tikus terhadap β-aktin (1 : 5000; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, AS) untuk kontrol pemuatan. Kemudian blot diinkubasi dengan antibodi sekunder terkonjugasi horseradish peroxidase (HRP) yang sesuai (1 : 5000; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, AS), divisualisasikan dalam larutan chemiluminescence yang ditingkatkan (SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate; Thermo Fisher) dan diekspos dengan UVP ChemiDoc-It2imager. Intensitas pita diukur menggunakan ImageJ (NIH) dan hasilnya dianalisis menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism (v9).
2.6 Ekspresi CCR9 dari The Cancer Genome Atlas
GEPIA (Gene Expression Profiling Interactive Analysis, http://gepia.cancer-pku.cn/index.html ) digunakan untuk menampilkan ekspresi gen CCR9 secara grafis dalam PDAC dan spesimen klinis normal yang cocok. Data dalam GEPIA diekstrak dari The Cancer Genome Atlas (TCGA) dan Genotype-Tissue Expression (GTEx) Project. Ekspresi gen CCR9 ditampilkan dalam log 2 (TPM+1) untuk skala log dalam bentuk diagram kotak untuk visualisasi.
2.7 Pewarnaan imunofluoresensi
Pewarnaan imunofluoresensi (IF) dilakukan untuk mengevaluasi ekspresi CCR9 dan lokalisasi CCR9 dalam PDO dan jaringan xenograft turunan pasien (PDX) seperti yang dijelaskan [ [ 10 , 11 ] ]. Antibodi primer yang digunakan untuk mewarnai jaringan adalah anti-PD1 tikus (1 : 150; Cell Marque, Rocklin, CA, AS), anti-CD3 kelinci (1 : 100; Proteintech), bersama dengan antibodi sekunder anti-tikus Alexa Fluor 555 kambing (1 : 500; Abcam, Waltham, MA, AS) dan anti-kelinci Alexa Fluor 488 kambing (1 : 500; Invitrogen). Antibodi primer yang digunakan untuk mewarnai PDO adalah anti-CD3 kelinci (1 : 100; Proteintech, Rosemont, IL, AS) dan anti-CK19 tikus (1 : 100; DSHB, Iowa City, IA, AS), bersama dengan antibodi sekunder anti-kelinci Alexa Fluor 647 (1 : 500; Abcam) dan anti-tikus Alexa Fluor 488 (1 : 500; Abcam). Antibodi sekunder saja digunakan sebagai kontrol antibodi. VectaShield dengan DAPI (Vector Laboratories) diaplikasikan pada sel yang diwarnai dan sel tersebut divisualisasikan menggunakan mikroskop confocal Nikon Ts2.
2.8 Analisis aliran sitometri
Ekspresi CCR9 permukaan sel dinilai dengan uji sitometri aliran seperti yang dijelaskan [ [ 11 ] ]. Sel PDAC ditanam pada cawan kultur 100 mm3 dan dipisahkan dengan asam tripsin-etilendiamintetraasetat (Gibco). Sel diperiksa dengan antibodi primer kelinci anti-CCR9 (1 : 100; Invitrogen) dan antibodi terkonjugasi tikus anti-CD45 APC/Cy7 (1 : 100; BioLegend, San Diego, CA, AS) selama 1 jam dalam buffer aliran (PBS/0,1% BSA) pada suhu 4 °C. Sel dicuci dan juga diinkubasi dengan antibodi sekunder fluoresen tikus anti-kelinci AlexaFlour 647 (1 : 500; Abcam) selama 1 jam pada suhu ruangan (RT). Sel kemudian difiksasi dalam paraformaldehida 2%. Analisis sitometri aliran dilakukan pada BD FACSymphony A3 (BD Sciences). Perangkat lunak FlowJo™ (v10) digunakan untuk analisis data.
2.9 Pengujian proliferasi sel
Sel PDAC ditanam pada pelat bening 96-sumur pada 5000 sel/100 μL/sumur dan dibiarkan menempel semalaman sebelum pengobatan. PDO dipisahkan menjadi sel tunggal seperti yang dijelaskan [ [ 9 ] ] dan ditanam pada 500–3000 sel/10 μL/sumur pada pelat putih dasar bening 96-sumur untuk analisis viabilitas. Sel diobati dengan kontrol antibodi isotipe IgG1, SRB2 (1–100 μg/mL; SunRock Biopharma, Santiago de Compostela, Spanyol), oksaliplatin (0–200 μg/mL; LC Labs), irinotecan (0–200 μg/mL; LC Labs), atau paclitaxel (0–200 μg/mL; LC Labs, Woburn, MA, AS) pada 8 konsentrasi dalam rangkap tiga selama 48 jam. Obat kemoterapi (oxaliplatin, irinotecan, dan paclitaxel) dipilih untuk pengujian karena merupakan komponen dari regimen kemoterapi PDAC standar (FOLFIRINOX dan gemcitabine/nab-paclitaxel) [ [ 12 ] ].
Viabilitas sel diukur menggunakan reagen WST-1 (Roche) untuk sel dan CellTiter-Glo® 3D Cell Viability Assay (Promega, Madison, WI, AS) untuk PDO. Kurva dosis-respons digambarkan dengan perangkat lunak GraphPad Prism (v9) dan nilai IC50 dihitung . Perkiraan dosis IC50 oksaliplatin pada setiap lini PDO digunakan untuk pengujian berikutnya dalam kombinasi dengan SRB2.
2.10 Uji ADCC pada sel PDAC
Darah dari donor yang sehat diekstraksi dan sel NK kemudian diisolasi menggunakan Kit Isolasi Sel NK (Miltenyi Biotec, Gaithersburg, MD, AS). Sel NK yang dimurnikan dianalisis untuk ekspresi CD3 dan CD56 dengan flow cytometry, dan preparat dengan kemurnian minimal 70% digunakan untuk pengujian selanjutnya.
Untuk uji sitotoksisitas, sel PANC-1 diinkubasi terlebih dahulu selama 30 menit dengan 10 μg/mL SRB2 (SunRock Biopharma) atau kontrol isotipe. Kemudian, sel dikultur bersama pada rasio 20 : 1 (sel NK : tumor) dengan sel NK manusia yang diisolasi selama 4 jam. Untuk mengidentifikasi populasi CCR9 + , sel diwarnai dengan anti-CCR9-phycoerythrin terkonjugasi (Thermo Fisher) selama 30 menit pada suhu kamar, kemudian diwarnai dengan pewarna hidup/mati Aqua (Invitrogen) selama 15 menit dan dianalisis dengan flow cytometry (perangkat lunak FlowJo™ v10). Sel CCR9 + dan CCR9 − diidentifikasi dan kematian sel ditentukan untuk kedua populasi dengan pewarnaan Aqua. Lisis sel spesifik untuk setiap populasi dihitung sebagai 100 × [(% sel target mati dalam sampel dengan anti-CCR9 mAb – % sel target mati dalam sampel dengan isotipe)/(100 – % sel target mati dalam sampel dengan isotipe)].
2.11 Khasiat obat in vivo
Spesimen tumor operatif manusia yang belum pernah mendapat pengobatan PDAC (hPT15) ditransplantasikan ke tikus NOD-SCID-gamma (Laboratorium Jackson, Gaithersburg, MD, AS) seperti yang dijelaskan [ [ 10 , 13 ] ]. Tumor PDX ini diperluas dan kemudian ditanamkan sebagai irisan berukuran 20–30 mm 3 ke dalam 48 tikus. Ketika ukuran tumor mencapai ~100 mm 3 2–3 minggu setelah penanaman, tikus dibagi secara acak ke dalam enam kelompok perlakuan: pelarut (kontrol negatif), Herceptin (10 mg/kg; Genentech, kontrol perlakuan mAb), SRB2 (20 mg/kg, SunRock Biopharma), oksaliplatin (10 mg/kg, Apotex, Weston, FL, AS), oksaliplatin + SRB2, dan oksaliplatin + Herceptin. Tikus diobati dengan suntikan intraperitoneal seminggu sekali. Tikus ditimbang dan ukuran tumor diukur dua kali seminggu dengan jangka digital selama 4 minggu.
Tikus NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull (NCG), strain tikus imunodefisiensi baru yang baru-baru ini dikembangkan untuk aplikasi IO, digunakan sebagai model tikus humanisasi [ [ 14 , 15 ] ]. Tikus NCG ditransplantasikan dengan sel punca hematopoietik CD34 + yang diisolasi dari darah tali pusat manusia setelah perawatan kemoablasi. Hematopoiesis lengkap direkapitulasi sepenuhnya, dan 14 minggu setelah pencangkokan CD34 + , sistem imun manusia yang berfungsi penuh terbentuk. Pertama, PDO PDAC (yaitu, hPT15) diperkuat ke dalam lima tikus stok imunodefisiensi. Setelah volume tumor mencapai 1000 mm 3 , tumor dipanen, dipotong menjadi bagian-bagian kecil, dan ditanamkan secara subkutan ke tikus NCG humanisasi. Setelah volume tumor rata-rata mencapai 101–105 mm3 , tikus diacak ke dalam empat kelompok perlakuan menurut volume tumor, donor darah tali pusat, dan tingkat humanisasi: pembawa (kontrol negatif), SRB2 (25 mg/kg Q7D), pembrolizumab (8 mg/kg Q3D) dan gemcitabine + nab-paclitaxel (masing-masing 50 dan 5 mg/kg Q7D). Tikus dipantau berat badan dan kesehatannya. Volume tumor diukur dua kali/tiga kali seminggu menggunakan jangka sorong.
Volume tumor ( V ) dihitung menggunakan rumus V = 1/2 (panjang × lebar 2 ). Volume tumor relatif dibandingkan antara kelompok perlakuan, di mana volume tumor relatif sama dengan volume tumor pada titik waktu penelitian relatif terhadap volume tumor awal.
2.12 Analisis histologi dan imunohistokimia
Tumor PDX yang dieksisi difiksasi dalam formalin 10% dan diserahkan ke University of Kentucky Biospecimen Procurement and Translational Pathology Shared Resource Facility untuk pemotongan histologis dan pewarnaan imunohistokimia (IHC) seperti yang dijelaskan [ [ 16 ] ]. Antibodi primer terhadap Ki-67 (1 : 100; Abcam) dan caspase-3 terbelah (CC3, 1 : 150; Cell Signaling) diinkubasi pada suhu 37 °C selama 1 jam diikuti dengan deteksi dengan Ventana OmniMap anti-rabbit-HRP (Roche) dan ChromoMap DAB (Roche, Weston, FL, AS). Untuk mengukur nekrosis dan proliferasi tumor, slide yang diwarnai hematoxylin dan eosin (H&E) pertama-tama dievaluasi untuk tumor, dan persentase jaringan tumor yang tidak dapat hidup diperkirakan untuk kasus yang berlaku. Potongan yang diberi imunopewarnaan Ki-67 diperiksa untuk memperkirakan indeks proliferasi keseluruhan dari seluruh tumor pada slide mikroskopis.
2.13 Analisis statistik
Hasil dari percobaan independen disajikan sebagai mean ± standar deviasi (SD) atau standar error of the mean (SEM), sebagaimana ditentukan. Untuk analisis dua kelompok, digunakan uji -t Student . ANOVA dua arah digunakan untuk perbandingan multikelompok kecuali dinyatakan lain. Analisis efek campuran digunakan untuk data PDX karena data tidak lengkap sekunder akibat kematian dini tikus. Secara khusus, satu dari delapan tikus dalam dua kelompok perlakuan yang berbeda mati sebelum titik waktu akhir. Analisis studi hewan humanisasi yang disajikan berdasarkan kelompok perlakuan dilakukan menggunakan ANOVA satu arah untuk mengevaluasi perbedaan antara kelompok perlakuan, diikuti oleh uji post hoc Tukey untuk beberapa perbandingan. Perbedaan dianggap signifikan pada P < 0,05. Analisis statistik dilakukan menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism (v9).
2.14 Persetujuan etika
Pekerjaan ini telah dilakukan sesuai dengan Prinsip Etika untuk Penelitian Medis yang Melibatkan Subjek Manusia (yaitu, Deklarasi Helsinki dari Asosiasi Medis Dunia). Persetujuan tertulis diperoleh dari pasien kanker pankreas untuk pengadaan spesimen tumor bedah. Analisis jaringan PDAC/pembuatan PDO dan analisis selanjutnya dilakukan di bawah otorisasi dari Dewan Peninjauan Institusional Medis Universitas Kentucky untuk penelitian ini (Protokol #48495). Untuk pengujian ADCC, persetujuan tertulis diperoleh dari donor darah sehat oleh Servizo de Vixilancia da Saude, Universitas Santiago de Compostela (Spanyol), di bawah otorisasi dari Comité Territorial de Ética de la Investigación de Santiago-Lugo untuk penelitian ini (Protokol #2019/054).
Percobaan PDX dilakukan sebagai studi yang disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional Universitas Kentucky (Protokol #2018-3116). Percobaan tikus yang dimanusiakan dilakukan berdasarkan persetujuan komite etik setempat untuk percobaan pada hewan (CELEAG) dan divalidasi oleh Kementerian Riset Prancis (Nomor persetujuan CELEAG APAFIS#38383).
3 Hasil
3.1 Ekspresi CCR9 pada sel dan jaringan PDAC
Kami mengevaluasi ekspresi CCR9 dalam sel dan jaringan PDAC menggunakan qPCR dan western blot. Di antara 4 lini sel PDAC (CAPAN-2, AsPC-1, MIAPaCa-2, dan PANC-1), MIAPaCa-2 dan PANC-1 memiliki kadar protein dan RNA CCR9 tertinggi (Gbr. S1 dan S2 ). Hasil kami menunjukkan tingkat ekspresi CCR9 yang bervariasi di antara spesimen klinis, dengan hPT15 PDO menampilkan ekspresi CCR9 tertinggi (Gbr. S1 ). Untuk menguatkan temuan kami, kami menggunakan TCGA dan mengamati tingkat ekspresi CCR9 yang heterogen dalam spesimen klinis PDAC ( N = 179) dibandingkan dengan tingkat yang umumnya rendah dalam jaringan normal yang cocok ( N = 171) (Gbr. S3 ).
3.2 Pengobatan SRB2 pada sel PDAC
Berdasarkan deteksi CCR9 dalam sel PDAC, kami menguji efek langsung paparan SRB2 pada CCR9 + sel MIAPaCa-2 dan PANC-1. Sel PDAC yang dikultur disimpan dalam formula bebas serum yang mengandung kontrol pelarut (0,1% BSA) atau CCL25 (400 ng/mL) selama 5 hari. MG132 (10 μM) digunakan sebagai kontrol positif sitotoksik. Reagen WST-1 (Roche) digunakan untuk mengukur proliferasi sel yang dimediasi CCL25. Hasil kami menunjukkan bahwa SRB2 (1, 10, 100 μg/mL) tidak memiliki sitotoksisitas langsung pada kedua lini sel PDAC (Gbr. 1 ).
Gbr. 1
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Proliferasi sel SRB2 dan PDAC. Hasil uji ini menunjukkan bahwa SRB2 tidak memiliki efek pada proliferasi sel PDAC yang diinduksi CCL25. CCL25 (400 ng/mL) menginduksi proliferasi sel MIAPaCa-2 (A) dan PANC-1 (B), sedangkan SRB2 tidak melemahkan proliferasi di kedua lini sel. MG132 (10 μM) digunakan sebagai kontrol sitotoksik positif. Ada satu replikasi biologis per kelompok, dan data disajikan sebagai mean ± SEM.
3.3 Uji ADCC pada lini sel PDAC
Kami menguji fungsi efektor (yaitu, ADCC) dari SRB2. Fungsi efektor ini dimediasi oleh domain Fc dari antibodi. Kami mengamati bahwa antibodi anti-CCR9 secara signifikan menginduksi lisis sel pada sel CCR9 + PANC-1, sedangkan antibodi tersebut tidak memengaruhi viabilitas sel pada sel CCR9 − (Gbr. 2 ).
Gambar 2
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Uji ADCC pada sel PANC-1. Sitotoksisitas yang diperantarai sel NK dipromosikan oleh SRB2. Lisis sel PANC-1 diukur setelah pengobatan dengan SRB2 (10 μg/mL) dan kultur bersama sel NK. Hasilnya menunjukkan lisis sel yang jauh lebih tinggi pada sel CCR9 + dibandingkan dengan sel CCR9 − . Ada 3 replikasi biologis yang disertakan, dan data disajikan sebagai mean ± SEM dan dibandingkan dengan uji- t Student yang tidak berpasangan .
Hasil uji ADCC menunjukkan bahwa ketika sel PANC-1 yang diobati dengan SRB2 (10 μg/mL) diekspos ke sel NK selama 4 jam, sitotoksisitas yang diperantarai sel NK menargetkan populasi CCR9 + pada sel PANC-1, sedangkan populasi CCR9 − sebagian besar tidak terpengaruh. Secara khusus, pengobatan anti-CCR9 menginduksi lisis sel sebesar 45,54 ± 6,35% dan 0,56 ± 0,062% pada sel CCR9 + dan CCR9 − , masing-masing (Gbr. 2 ). Lebih jauh lagi, tidak ada efek sitotoksik yang diamati tanpa adanya sel NK, yang menunjukkan peran sel efektor ini dalam imunoterapi berbasis SRB2.
3.4 Sitotoksisitas SRB2 pada PDO dan PDX
Kami menguji satu galur PDO lintasan awal dengan SRB2 (0–100 μg/mL), oksaliplatin (0–200 μg/mL), irinotecan (0–200 μg/mL), atau paclitaxel (0–200 μg/mL) selama 48 jam. Hasil penelitian menunjukkan bahwa sitotoksisitas SRB2 pada galur PDO bergantung pada dosis dengan sitotoksisitas tertinggi antara 10 dan 100 μg/mL (Gbr. 3A ). Perkiraan IC50 masing -masing obat selanjutnya digunakan dalam kombinasi pengobatan dengan SRB2. SRB2 menunjukkan sitotoksisitas yang serupa dengan irinotecan dan oksaliplatin (keduanya P > 0,05). Paclitaxel menunjukkan sitotoksisitas tertinggi, yang secara statistik signifikan dibandingkan dengan pengobatan lainnya. Sitotoksisitasnya lebih rendah untuk SRB2 + irinotecan dibandingkan dengan irinotecan saja ( P = 0,02) tetapi serupa untuk kombinasi SRB2 dengan oksaliplatin dan paclitaxel jika dibandingkan dengan obat-obatan individual (keduanya P > 0,05).
Gambar 3
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Efek in vitro dan in vivo dari SRB2. Di sini, SRB2 diberikan sendiri dan dalam kombinasi dengan obat sitotoksik pada PDO PDAC dan hewan PDX. Kurva dosis-respons SRB2, irinotecan, oxaliplatin, dan paclitaxel ditunjukkan untuk PDO hPT15 (A). Data mencakup tiga replikasi biologis dan disajikan sebagai mean ± SD. Grafik batang menunjukkan efek SRB2 dan/atau obat sitotoksik ( n = 4 replikasi biologis per kelompok perlakuan) (A). Data disajikan sebagai mean ± SD dan dibandingkan menggunakan ANOVA dua arah. Kemudian, efek SRB2 dan obat sitotoksik/target dievaluasi pada hewan CCR9 + PDAC PDX. Kami mengamati tren penurunan pertumbuhan tumor pada kelompok perlakuan eksperimental dibandingkan dengan kelompok kontrol (B). N = 8 tikus diuji per kelompok perlakuan. Data PDX disajikan sebagai mean ± SD dan dibandingkan menggunakan analisis efek campuran.
Untuk mendukung hasil studi in vitro , kami mengevaluasi efek SRB2 pada hewan PDAC PDX. Kami memilih hPT15 PDO untuk xenografting karena garis ini memiliki ekspresi CCR9 tertinggi dari data qPCR dan western blot kami (Gbr. S1 ). Hasil studi in vivo menunjukkan bahwa tikus yang diobati dengan SRB2 mengalami penurunan pertumbuhan tumor dibandingkan dengan kelompok kontrol dan sitotoksisitas yang serupa dengan oksaliplatin. Sementara laju pertumbuhan tumor dan volume tumor yang dieksisi tidak berbeda secara statistik antara keempat kelompok perlakuan (SRB2, oksaliplatin, SRB2 + oksaliplatin, dan oksaliplatin + Herceptin; P > 0,05), SRB2 + oksaliplatin memiliki pertumbuhan tumor terendah secara keseluruhan (Gbr. 3B ).
Setelah dilakukan studi volumetrik, tumor difiksasi dan diproses untuk H&E dan IHC. Potongan tumor menunjukkan temuan morfologi serupa yang terdiri dari karsinoma dengan diferensiasi skuamosa yang jelas, diferensiasi glandular fokal pada sebagian besar tumor, dan berbagai tingkat tumor yang tidak dapat hidup.
Proliferasi tumor (Ki-67) dan nekrosis (CC3) dievaluasi mengikuti pewarnaan IHC menggunakan estimasi % pewarnaan positif dibandingkan dengan total tumor. Potongan imunopewarnaan positif CC3 berkorelasi kira-kira dengan persentase tumor tidak hidup yang dicatat pada potongan pewarnaan H&E. Kelimpahan Ki-67 terbesar ditemukan pada kelompok pelarut dan SRB2. Ki-67 terendah ditemukan pada kelompok oksaliplatin + SRB2. Demikian pula, CC3 terendah diamati pada kelompok pelarut dan oksaliplatin + herceptin, sedangkan CC3 tertinggi berada pada kelompok SRB2. Dengan kombinasi Ki-67 dan CC3, proliferasi terendah (Ki-67) dan % nekrosis (CC3) tertinggi diamati pada kelompok oksaliplatin + SRB2, diikuti oleh oksaliplatin saja (Gbr. 4 ).
Gambar 4
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Pengukuran IHC terhadap proliferasi (Ki-67) dan nekrosis (CC3). Tumor yang dieksisi dari dua tikus per kelompok perlakuan (total n = 12) dipotong dan analisis IHC dilakukan untuk Ki-67 (biru) dan CC3 (oranye). Hasilnya menunjukkan nekrosis tertinggi (CC3) dengan SRB2 dan proliferasi terendah (Ki-67) dengan SRB2 + oxaliplatin. Data ditampilkan sebagai mean ± SEM.
3.5 Komponen sel imun dari PDO dan PDX yang mengalami transisi awal
Kami berusaha mengidentifikasi populasi sel heterogen dalam PDO dan PDX, terutama pada tahap awal (<4). Hasil kami mengungkapkan populasi sel T yang tertahan (CD3 berwarna ungu) pada PDO tahap awal hPT15 (Gbr. 5A ). Dengan pewarnaan IF jaringan PDX, kami mengamati sel PD1 + /CD3 + (kuning), yang menunjukkan populasi sel T (Gbr. 5B ). Dengan flow cytometry, kami mendeteksi 30,4% sel CD45 + dan 12,7% sel CCR9 + dalam jaringan (Gbr. 5C,D ). Lebih jauh, ekspresi CCR9 dicatat pada populasi sel PDO CD45 + (8,86%) dan CD45 − (3,85%), yang menunjukkan ekspresi CCR9 pada limfosit infiltrasi dan sel kanker dalam PDX.
Gambar 5
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Populasi sel imun pada PDO PDAC dan PDX. (A) Pewarnaan IF untuk CK19 (hijau) dan CD3 (merah) pada PDO hPT15 menunjukkan sel imun dan sel kanker yang tertahan pada PDO tahap awal. (B) Pewarnaan IF untuk CD3 dan PD1 pada slide jaringan PDX hPT15 menunjukkan pewarnaan untuk CD3 (hijau) dan PD1 (merah). Hamparan (kuning) dari kedua penanda menunjukkan sel imun. Skala batang pada A dan B menunjukkan 10 μm. Plot titik pseudocolor (C) dan plot kontur (D) menunjukkan proporsi CCR9 dan CD45 positif tunggal (Q1,3) dan positif ganda (Q2), serta populasi negatif ganda (Q4) di dalam tumor. Sitometri aliran dilakukan menggunakan mesin BD FACSymphony A3 dan dianalisis menggunakan Perangkat Lunak FlowJo v10.
3.6 Efek SRB2 pada hewan yang dihumanisasi NCG
Setelah menunjukkan kemanjuran SRB2 dengan model in vivo dan menjelaskan fungsi efektornya, SRB2 diuji pada model tikus dengan sistem imun humanisasi yang sepenuhnya utuh (yaitu, tikus humanisasi NCG). Penelitian ini dirancang untuk mengevaluasi kemanjuran SRB2 dengan pengobatan standar untuk kanker pankreas stadium lanjut dan metastasis (gemcitabine + nab-paclitaxel) atau imunoterapi (pembrolizumab) pada tikus humanisasi yang dicangkok dengan tumor PDAC. Kami memilih hPT15 PDAC yang sama dengan ekspresi CCR9 yang tinggi untuk lebih memvalidasi mekanisme kerja SRB2 yang dimaksudkan dalam model in vivo ini .
Kami mengamati bahwa SRB2 aman ketika disuntikkan secara intravena pada 25 mg/kg pada tikus humanisasi. Ketika menilai perbandingan kohort pengobatan multikelompok, volume tumor rata-rata tidak berbeda secara statistik antara kelompok, kecuali untuk SRB2 dibandingkan dengan pembawa ( P = 0,031) (Gbr. 6 ). Ketika memeriksa kohort pengobatan individu, SRB2 sekali lagi memiliki kemanjuran antitumor yang meningkat secara signifikan dibandingkan dengan pembawa ( P = 0,038) (Gbr. S4 ). Khususnya, kohort SRB2 memiliki regresi tumor lengkap untuk dua tikus, yang bebas dari tumor pada penyelesaian studi. Pada penyelesaian studi, tumor diinfiltrasi dengan baik oleh semua jenis sel imun manusia, termasuk leukosit manusia, sel T CD3 + , sel T CD4 + , sel T CD8 + , Treg, sel NK, sel myeloid, dan monosit/makrofag (data tidak ditampilkan) yang menunjukkan mekanisme kerja SRB2 yang digerakkan oleh ADCC.
Gbr. 6
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Kurva pertumbuhan tumor pada tikus humanisasi NCG. Tikus NCG dengan PDAC xenograft diobati dengan pembawa, SRB2 (25 mg/kg), pembrolizumab (8 mg/kg) atau gemcitabine (50 mg/kg) + nab-paclitaxel (5 mg/kg). Volume tumor terendah untuk SRB2 dibandingkan dengan pembawa ( P = 0,031). Rata-rata ± SEM untuk volume tumor untuk setiap kelompok pengobatan dinyatakan dalam mm3 dengan N = 8 tikus per kelompok. Kelompok-kelompok tersebut dibandingkan dengan ANOVA dua arah.
4 Diskusi
TME PDAC terdiri dari sejumlah jenis sel yang mengoordinasikan jalur pensinyalan untuk mendukung pertumbuhan kanker sekaligus menekan fungsi imun. Sumbu kemokin CCR9 pertama kali dijelaskan dalam perkembangan timosit dan kemotaksis dan telah menjadi perhatian besar dalam pematangan sel T karena membedakan garis keturunan CD4 vs. CD8. Namun, laporan sekarang menunjukkan bahwa CCR9 diekspresikan pada sel kanker dan sel stroma dalam TME PDAC dan mengatur proliferasi dan invasi sel PDAC. Ketika peran imunologis dan onkologis dari sumbu CCR9/CCL25 dipertimbangkan, tampaknya menjadi target terapi yang ideal untuk membunuh sel kanker secara langsung, untuk melawan fibroblas stroma dalam TME PDAC, dan untuk mengaktifkan kembali sel imun sitotoksik.
Kegagalan agen IO dalam PDAC sebagian disebabkan oleh TME PDAC yang padat, tetapi juga disebabkan oleh jalur pelarian dari efektor pensinyalan alternatif. Di sini, hasil kami menunjukkan bahwa SRB2 (anti-CCR9 mAb) dapat membantu mengatasi resistensi imun dengan secara langsung menargetkan titik pemeriksaan imun kandidat CCR9 dan dengan menghambat pelepasan CCL25 (ligan untuk CCR9). SRB2 berfungsi sebagai anti-CCR9 mAb humanisasi rekayasa Fc yang meningkatkan fungsi efektor Fc untuk memperoleh respons efektor yang lebih baik. Selain menghasilkan kematian sel melalui ADCC, SRB2 memiliki potensi untuk memblokir pensinyalan reseptor-ligan untuk kemudian menghambat proliferasi dan invasi sel PDAC yang dimediasi CCL25. Oleh karena itu, menargetkan CCR9 dapat meningkatkan kemanjuran ICI saat ini dengan memblokir jalur penghindaran imun alternatif. Yang penting, penelitian kami menunjukkan potensi aplikasi terapeutik SRB2 dalam CCR9 + PDAC.
Bahasa Indonesia: Untuk menilai efikasi SRB2 secara akurat, model imunokompeten merupakan prasyarat untuk studi investigasi kami. Memang, efek sitotoksik diamati pada PDO dan PDX yang mengandung populasi sel CD3 + dan CD45 + , tetapi tidak pada lini sel PDAC. Faktanya, kami menunjukkan bahwa PDO PDAC tidak hanya mencakup sel kanker tetapi juga sel imun dan stroma pada PDO tahap awal. Khususnya, kami menunjukkan bahwa hasil untuk pengujian obat kombinasi serupa antara model PDO dan PDX. Sementara model PDO dan PDX keduanya merangkum TME PDAC, waktu untuk pembentukan model lebih cepat dan biaya lebih rendah saat menggunakan PDO [ [ 17 ] ]. Yang penting, hasil studi kami menunjukkan signifikansi statistik dalam aktivitas sitotoksik menggunakan SRB2 saja jika dibandingkan dengan kendaraan saja. Demonstrasi aktivitas positif dalam terapi SRB2 dari studi percontohan yang mengevaluasi berbagai lengan pengobatan adalah dasar untuk studi yang lebih terfokus dan bertenaga.
Terapi sistemik standar untuk semua pasien PDAC adalah regimen FOLFIRINOX atau gemcitabine/nab-paclitaxel [ [ 12 ] ]. Sayangnya, pasien PDAC dengan penyakit yang tidak dapat direseksi memiliki median kelangsungan hidup < 1 tahun, dan pasien yang menjalani reseksi bedah penyakit dan menerima kemoterapi perioperatif memiliki tingkat kelangsungan hidup 5 tahun sekitar 20% [ [ 18 – 20 ] ]. Dengan demikian, kurangnya pilihan imunoterapi sangat mencolok dan mencerminkan kegagalan pendekatan masa lalu untuk menggabungkan agen IO. Namun, jelas bahwa strategi terapi yang lebih efektif untuk memperpanjang kelangsungan hidup PDAC akan memerlukan penggabungan terapi berbasis imun yang rasional. Studi kami saat ini memberikan laporan pertama dari anti-CCR9 mAb humanisasi baru dan aktivitas terapeutiknya dalam menargetkan PDAC. Mengingat aktivitas in vitro dan in vivo , SRB2 menunjukkan potensi besar untuk terapi multimoda pada PDAC.
