Abstrak
Terapi yang ditargetkan telah meningkatkan protokol klinis secara menyeluruh dan secara signifikan meningkatkan kelangsungan hidup dan kualitas hidup pasien kanker. Sebagian besar didasarkan pada molekul kecil dan antibodi yang menargetkan mekanisme yang tidak diatur dalam sel kanker, pendekatan onkologi presisi terbatas pada beberapa jenis tumor karena kelangkaan target yang dapat ditindaklanjuti secara klinis. Di sini, kami melaporkan analisis komparatif dari reseptor potensial transien saluran kation melastatin 8 (TRPM8; juga dikenal sebagai subfamili M anggota saluran kation potensial transien 8) pada kanker paru-paru, payudara, kolorektal, dan prostat. Temuan kami mengungkapkan tingkat ekspresi saluran yang tinggi dalam inti dari keempat karsinoma, terlepas dari ekspresi RNA yang berkurang. Yang penting, lini sel kanker yang mewakili berbagai jenis tumor secara konsisten menunjukkan bahwa dosis kemoterapi sub-mematikan yang dikombinasikan dengan agonis TRPM8 D-3263 memiliki efek mematikan yang sinergis. Selain itu, pemberian D-3263 meningkatkan sitotoksisitas 5-FU/Oxaliplatin pada organoid kanker kolorektal yang berasal dari pasien, tergantung pada kadar TRPM8. Secara keseluruhan, penelitian kami memperkuat pencalonan TRPM8 sebagai target molekuler untuk pendekatan onkologi presisi dan membuka jalan bagi perancangan uji coba keranjang untuk pengujian klinisnya pada tumor dengan kadar TRPM8 tinggi.
Singkatan
ATCC
Koleksi Budaya Tipe Amerika
SM
kanker payudara
BME
ekstrak membran dasar
BPE
ekstrak kelenjar pituitari sapi
BSA
albumin serum sapi
CRC
Kanker kolorektal
COLEK
3,3′-Diaminobenzidin
EKL
peningkatan chemiluminescence
EGF
faktor pertumbuhan epidermis
FBS
serum janin sapi
FFPE
formalin-fiksasi parafin-tertanam
Bahasa Indonesia: FITC
fluorescein isothiosianat
GAPDH
gliseraldehida-3-fosfat dehidrogenase
IR
radiasi pengion
KSFM
medium bebas serum keratinosit
NSCLC
kanker paru non sel kecil
PARP
poli (ADP-ribosa) polimerase
PCa
kanker prostat
PDO
organoid yang berasal dari pasien
PDXO
xenoorganoid yang berasal dari pasien
PFA
paraformaldehida
PI
propidium iodida
PVDF
polivinilidena difluorida
RNAseq
Pengurutan RNA
RPLP
subunit P batang lateral protein ribosom
RTK
reseptor tirosin kinase
siRNA
RNA pengganggu pendek
TBS
larutan garam penyangga tris
TCGA
Atlas Genom Kanker
TMA
jaringan mikroarray
TRP2
potensi reseptor sementara melastatin 2
TRPM8
potensi reseptor sementara melastatin 8
5-FU
5-fluorourasil
1 Pendahuluan
Investigasi omik melalui teknologi mutakhir telah terbukti penting untuk mengurai heterogenitas molekuler dan kompleksitas biologi kanker [ [ 1 , 2 ] ]. Semakin sering, tanda tangan molekuler yang ditentukan digunakan di klinik untuk mengklasifikasikan tumor padat dan cair dalam kategori yang dapat ditindaklanjuti dan mengelompokkan pasien pada protokol onkologi yang tepat [ [ 3 , 4 ] ]. Intervensi terapi yang ditargetkan yang diarahkan terhadap mekanisme onkogenik spesifik atau kerentanan sel kanker telah secara signifikan mengubah prognosis tumor mematikan seperti kanker paru-paru, payudara, prostat, dan kolorektal ( https://www.cancer.gov/about-cancer/treatment/types/targeted-therapies/approved-drug-list ). Penghambatan reseptor tirosin kinase (RTK), enzim yang terlibat dalam perbaikan DNA, dan komponen titik pemeriksaan imun adalah salah satu strategi istimewa yang diadopsi oleh onkologi modern untuk melawan perkembangan kanker. Umumnya efektif untuk kelas tumor molekuler yang tepat, mekanisme resistensi hampir selalu muncul, dan penyakit pasti kambuh [ [ 5 ] ]. Untuk mengatasi resistensi terapi, portofolio besar obat yang lebih kuat dan selektif sedang dalam penyelidikan klinis berkelanjutan ( https://clinicaltrials.gov/ ), sementara, di sisi lain, upaya penelitian pra-klinis yang tak kenal lelah mengisi daftar tersebut dengan kandidat obat baru yang menjanjikan.
Dalam pencarian panik untuk pengobatan yang lebih baik dan strategi terapi baru, penggerbangan saluran ion secara farmakologis merupakan sumber daya yang tak ternilai bagi onkologi yang patut mendapat perhatian besar [ [ 6 ] ].
Gen Transient Receptor Potential ( TRP ) mengkode saluran ion membran sel yang sangat terkonservasi dari ragi hingga mamalia dengan peran penting dalam persepsi sensorik dan fisiologi seluler [ [ 7 ] ]. Pada mamalia, famili TRP terdiri dari subfamili multi-gen termasuk TRPA1 (ankyrin), TRPC (kanonik), TRPML (mucolipin), TRPM (melastatin), TRPP (polycystin), dan TRPV (vanilloid) [ [ 8 ] ]. Sebagian besar TRP adalah saluran kation non-selektif yang mekanisme gatingnya berkisar dari variasi potensial transmembran atau suhu hingga pengikatan ligan spesifik. Dengan mendepolarisasi membran sel saat diaktifkan, beberapa TRP berfungsi sebagai saluran pelepasan Ca 2+ intraseluler , sehingga memiliki peran penting dalam biologi sel. Dari perspektif klinis, mutasi pada gen TRP telah terlibat dalam kelainan herediter (channelopathies TRP) seperti displasia skeletal, sindrom neurodegeneratif, disfungsi ginjal, dan nyeri [ [ 7 , 9 , 10 ] ]. Karena lokasinya pada permukaan sel dan keberadaan kantong pengikat ligan spesifik, beberapa saluran TRP adalah target obat arketipe yang gerbang farmakologisnya dapat memiliki implikasi klinis yang relevan mulai dari penghilang rasa sakit hingga penyakit pernapasan, dari kelainan neurologis dan psikiatris hingga diabetes dan kanker [ [ 7 , 11 ] ]. Di antara anggota keluarga TRP, gen saluran kation Transient Receptor Potential subfamili M member 8 – TRPM8 – dilaporkan dalam literatur diekspresikan secara melimpah di kompartemen luminal epitel prostat normal [ [ 12 – 15 ] ]. Meskipun perannya masih kurang jelas, TRPM8 meningkat pada kanker prostat (PCa) dibandingkan dengan jaringan normal yang berdekatan pada tingkat RNA dan protein, yang menunjukkan aktivitas pro-tumorigenik saluran tersebut. Patut dicatat, semakin banyak publikasi yang menyoroti sensitivitas tajam berbagai model pra-klinis PCa terhadap penyetelan farmakologis TRPM8 [ [ 16 – 18 ] ]. Penelitian kami sebelumnya [ [ 12 – 14 ] ] menunjukkan respons apoptotik masif dari model seluler lintas spesies PCa yang agresif terhadap kombinasi perawatan standar sub-mematikan (IR, kemoterapi, terapi hormon) dengan agonis TRPM8 yang poten (WS-12 dan D-3263).
Di sini, kami menjelaskan kemanjuran penargetan TRPM8 pada tiga pembunuh manusia utama lainnya seperti kanker paru-paru, payudara, dan kolorektal. Meskipun jumlah RNA TRPM8 yang dilaporkan oleh The Cancer Genome Atlas (TCGA) rendah untuk tumor selain PCa, imunolokalisasi TRPM8 mengidentifikasi inti kanker payudara, paru-paru, dan kolorektal pada mikroarray multi-tumor (TMA) dengan kadar saluran yang sebanding dengan PCa. Yang penting, kombinasi dosis sub-mematikan kemoterapi standar dengan agonis TRPM8 yang poten D-3263 menginduksi program apoptosis yang luas pada lini sel kanker payudara, paru-paru, usus besar, dan prostat. Knock-down TRPM8 mencegah kematian sel pada semua lini sel, sehingga membuktikan spesifisitas D-3263. Demikian pula, D-3263 meningkatkan sitotoksisitas 5-FU/Oxaliplatin pada organoid kanker kolorektal yang berasal dari pasien, tergantung pada kadar ekspresi protein TRPM8.
Secara keseluruhan, hasil ini menjelaskan nilai TRPM8 sebagai target molekuler untuk pengobatan berbagai jenis tumor, terlepas dari jaringan asal dan jumlah RNA, tetapi dipilih berdasarkan tingkat ekspresi saluran yang tinggi.
2 Bahan dan Metode
2.1 Kultur sel
LNCaP (#CRL-1740; RRID:CVCL_0395), PC-3 (#CRL-1435; RRID:CVCL_0035), VCaP (#CRL-2876; RRID:CVCL_2235), RWPE-1 (#CRL-11609; RRID:CVCL_3791), A549 (#CCL-185; RRID:CVCL_0023), HCT116 (#CCL-247; RRID:CVCL_0291), MCF7 (#HTB-22; RRID:CVCL_0031), SK-MEL5 (#HTB-70; RRID:CVCL_0527), G361 (#CRL-1424; RRID:CVCL_1220), dan A375 Lini sel (#CRL-1619; RRID:CVCL_0132) dibeli dari American Type Culture Collection (ATCC, LGC Standards). Sel-sel tersebut ditumbuhkan dalam medium RPMI (Sigma, St. Louis, MO, AS) atau dalam medium DMEM (MCF7, VCaP, A375, G361, SK-MEL5; Invitrogen, ThermoFisher Sci, Waltham, MA, AS) yang dilengkapi dengan 10% serum fetal bovin (FBS; Sigma), 100 U·mL −1 penisilin, dan 100 μg·mL −1 streptomisin (Pen/Strep; Invitrogen dan 2 m m L-Glutamin (Invitrogen)). Sel RWPE-1 dikultur dalam medium KSFM (Invitrogen) yang dilengkapi dengan 0,05 mg·mL −1 ekstrak pituitari sapi (BPE), 5 ng·mL −1 EGF, dan 1% Pen/Strep. Semua sel dikultur dalam inkubator yang dilembabkan pada suhu 37 °C dan 5% CO 2 dan disalurkan sesuai dengan protokol pabrik pembuatnya. Lini sel secara rutin diuji untuk Mycoplasma (MycoAlert Mycoplasma Detection Kit, Lonza) dan diautentikasi untuk penanda spesifik dengan western blot dan RT-qPCR.
2.2 Sampel manusia
Mikroarray jaringan (TMA) kepadatan tinggi dari tumor kolon, rektum, payudara, paru-paru, dan prostat, yang berisi 208 kasus/208 inti (192 kasus tumor dan 16 kasus jaringan normal) dibeli dari US Biomax, Inc. (MC2081a). Delapan TMA kanker kolorektal yang berisi 80 kasus (160 inti, 1 inti jaringan tumor, dan 1 inti mukosa normal kontrol dari setiap pasien) dihasilkan dari sampel yang disimpan FFPE di Unit Operasi Patologi Anatomi Rumah Sakit Santa Chiara (Trento, Italia) setelah persetujuan studi dari Komite Etik lokal Rumah Sakit Santa Chiara (Trento, Italia) (Prot.:1946 ID:112786962). Sampel dikumpulkan secara acak dengan memperhatikan stadium dan tingkatan. Spesimen kanker kolorektal dan prostat manusia diambil dari reseksi segmental usus besar di Rumah Sakit Santa Chiara Trento (Agustus–November 2011) dan prostatektomi radikal di Rumah Sakit Molinette Turin (Italia) (Januari–Februari 2020). Pasien kanker prostat didaftarkan dengan persetujuan tertulis berdasarkan protokol studi yang disetujui oleh Komite Etik Rumah Sakit Molinette, Turin (Rep. Int. 0009136). Sampel tumor kolorektal beku yang dikumpulkan dengan persetujuan tertulis dari pasien diambil dari bank jaringan Rumah Sakit Santa Chiara (Trento, Italia). Metodologi studi yang sesuai dengan standar yang ditetapkan oleh Deklarasi Helsinki disetujui oleh komite etik lokal Rumah Sakit Molinette di Turin, Italia, dan Rumah Sakit Santa Chiara di Trento, Italia.
2.3 Isolasi RNA dan PCR kuantitatif
Ekstraksi RNA dilakukan menggunakan RNAeasy Micro Kit (Qiagen) mengikuti petunjuk pabrik pembuatnya. Konsentrasi dan kualitas RNA dievaluasi dengan spektrofotometer NanoDropTM 2000c (ThermoFisher Sci, Waltham, MA, AS) dan elektroforesis agarosa. Total RNA (1 μg) ditranskripsi balik menjadi cDNA menggunakan iScript™ cDNA synthesis Kit (Biorad) sesuai dengan protokol pabrik pembuatnya. PCR kuantitatif waktu nyata dilakukan pada CFX96 qPCR Thermal cycler (Biorad) menggunakan KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (Kapa biosystems, Wilmington, MA, AS). Data dinormalisasi ke gen housekeeping Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ( GAPDH ) atau transkrip beta-ACTIN ( b-ACTIN ) untuk analisis ekspresi TRPM8 dalam lini sel kanker atau ke rata-rata geometrik transkrip GAPDH , RPLP , dan 18S untuk analisis ekspresi TRPM8 dalam sampel prostat dan kolorektal manusia, dianalisis sebagai kadar RNA relatif dari nilai ambang siklus (Ct), kemudian dikonversi ke perubahan lipatan. Analisis PCR dilakukan dengan sedikitnya n = 2 replikasi biologis independen. Primer PCR sense dan antisense spesifik yang digunakan dalam penelitian ini adalah: TRPM8 , GATTTTCACCAATGACCGCCG (Fw), CCCCAGCAGCATTGATGTCG (Rv); GAPDH , AGCCACATCGCTCAGACACC (Fw), GTACTCAGCGCCAGCATCG (Rv); RPLP , CGTCCTCGTGGAAGTGACAT (Fw), TAGTTGGACTTCCAGGTCGC (Rv); 18S , CAGCCACCCGAGATTGACA (Fw), TAGTAGCGACGGGCGGTGTG (Fw); bACTIN , AGAGATGGCCACGGCTGCTT (Fw), ATTTGCGGTGGACGACGATGGAG (Rv).
2.4 Western blot
Imunoblotting dilakukan seperti yang dilaporkan sebelumnya [ [ 12 , 14 ] ]. Singkatnya, jumlah protein yang sama dipisahkan dengan SDS/PAGE, ditransfer ke membran PVDF (AmershamTM Hybond™; Fisher Scientific, Buckinghamshire, Inggris) dan diblokir dengan 5% BSA atau 5% susu bubuk tanpa lemak dalam 1× TBS-Tween. Antibodi primer berikut digunakan: anti-TRPM8 (ACC-049, Alomone Labs dan ab3243; Abcam), -TRPM2 (PA5-102844, ThermoFisher Science), -PARP (9542; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, AS), -Cleaved PARP (Asp214, 5625, Cell Signaling Technology), -Cleaved Caspase-3 (Asp175, 9661, Cell Signaling Technology) dan -β-Actin (A2228, Sigma). Reaksi tersebut terungkap dengan menggunakan ECL Select WB Detection Reagent (GE Healthcare, Little Chalfont, Inggris) dengan sistem dan perangkat lunak Alliance LD2 (UVITEC). Imunoblot dilakukan dalam tiga replikasi biologis independen dan dikuantifikasi dengan ImageJ (v2.0.0-rc-69/1.52i); data representatif ditampilkan.
2.5 Pembungkaman RNA pengganggu kecil
Sel-sel ditanam pada pelat enam sumur (2 × 105 sel /sumur) dan ditransfeksi sementara pada sekitar 60% konfluensi dengan siRNA target terhadap TRPM8 atau TRPM2 manusia (100 nm ) atau siRNA kontrol negatif (lihat di bawah) menggunakan Lipofectamine® LTX Reagent (Life Tech, ThermoFisher Sci, Waltham, MA, AS) dan media OptiMEM (Invitrogen) seperti yang dijelaskan dalam protokol pabrik. Untuk TRPM8, urutan siRNA berikut digunakan: siRNA1 GGUGCUUUGGAUUCUCACGG (Ambion 104 796, Life Tech), siRNA2 GGAUGCCCUGACAUCUUUCU (Ambion 104 798, Life Tech), siCtr Silencer® Kontrol Negatif #1 (Ambion AM4611, Life Tech). Urutan siRNA TRPM2 (si-TRPM2#1, si-TRPM2#, si-NC) diperoleh dari [ [ 19 ] ] dan dibeli dari Eurofins Genomics.
2.6 Obat-obatan
Docetaxel (01885, 10 mm ) , Oxaliplatin (09512, 50 mm ) dan 5-Fluorouracil (F6627, 500 mm ) , dan WS-12 (W0519, 10 mm ) dibeli dari Sigma; D-3263 (D-195, 10 mm ) diperoleh dari Alomone Labs dan disuspensikan kembali dalam dimetil sulfoksida (DMSO) untuk mencapai konsentrasi stok yang ditunjukkan. Semua obat dipertahankan sebagai larutan stok dan disimpan pada suhu -80 °C atau -20 °C. Dalam setiap percobaan, volume pelarut yang sama yang digunakan untuk obat dan bahan kimia yang diuji ditambahkan ke larutan kontrol.
2.7 Analisis FACS
Sel dikultur pada sekitar 60% konfluensi dalam cawan enam sumur dan diperlakukan selama 24 jam seperti yang ditunjukkan dalam gambar. Tingkat kematian sel dan apoptosis ditentukan dengan pewarnaan Annexin-V-FITC dan propidium iodida (PI) sesuai dengan petunjuk pabrik (Annexin-V FITC Kit; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Jerman). Untuk analisis FACS, BD FACSymphony™ A1 Cell Analyzer (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, AS) digunakan, dan data dianalisis dengan perangkat lunak FlowJo (Treestar, Ashland, AS).
2.8 Uji sitotoksisitas sel kristal violet
Pelat enam sumur dengan 70% sel konfluen diperlakukan seperti yang ditunjukkan dalam gambar. Dua puluh empat jam kemudian, sel dicuci dengan PBS, difiksasi dengan formalin 10% (Sigma), dicuci lagi dengan PBS, dan diwarnai dengan larutan Kristal Violet 0,1% (Sigma) (dalam metanol 20%) selama 30 menit. Setelah itu, sel dicuci dengan dH20, dikeringkan, dan Kristal Violet diekstraksi dengan asam asetat 10% selama 30 menit. Untuk kuantifikasi, absorbansi diukur pada 595 nm. Percobaan dilakukan dalam rangkap tiga, dan gambar diambil dengan Chemidoc XRSF (Biorad).
2.9 Imunohistokimia
Sel ditumbuhkan pada penutup kaca, difiksasi dengan 4% PFA, diinkubasi dengan larutan penghambat peroksidase, dijenuhkan selama 1 jam pada suhu RT dan, akhirnya, diinkubasi dengan antibodi primer (anti-TRPM8 Alomone Labs ACC-049 atau Abcam Ab3243) O/N pada suhu 4 °C. Penutup kaca dicuci lalu diinkubasi dengan antibodi sekunder terkonjugasi biotin (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, AS) selama 1 jam pada suhu RT, dicuci lagi, dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu RT dengan kompleks Avidin-Biotin (kit Vectastain® Elite ABC Peroxidase, Vector Labs, PK-6100, Burlington, CA, AS) sesuai dengan petunjuk pabrik. Sampel diinkubasi dengan larutan pewahyuan DAB dan diwarnai tandingan dengan hematoksilin sebelum memasang penutup kaca. TMA menjadi sasaran analisis imunohistokimia yang dilakukan di Departemen Histopatologi (Rumah Sakit S. Chiara, Trento, Italia) menggunakan imunopewarna otomatis (platform BOND-III, Leica Biosystems, Wetzlar, Jerman). Pengambilan antigen dilakukan dengan reagen BOND yang dioptimalkan (larutan pengambilan epitop Bond 1, Leica Biosystems) pada pH 6 selama 20 menit. Larutan deteksi polimer padat BOND (Leica Biosystems) digunakan untuk deteksi, seperti yang dijelaskan sebelumnya [ [ 12 – 14 ] ]. Antibodi primer yang digunakan untuk mendeteksi TRPM8 adalah Alomone Labs ACC-049 atau Abcam Ab3243 yang diencerkan pada 1:800 untuk digunakan pada sistem BOND. Histologi sampel dan imunopewarnaan TRPM8 ditinjau secara independen oleh tiga ahli patologi (MB, FGC, dan GB) untuk memastikan penugasan skor yang tepat berikut: tidak adanya pewarnaan (0), intensitas sinyal lemah (1), sedang (2), dan tinggi (3).
2.10 Organoid kolorektal
PDO dan xenoorganoid yang berasal dari pasien (PDXO) dibuat dan dipelihara dalam kultur sebagaimana dijelaskan secara lengkap di [ [ 20 ] ]. Secara singkat, sampel tumor diperoleh dari pasien yang terdaftar di Niguarda Cancer Center (Milan, Italia) (pasien #2–5) dan dari University of Rostock (Jerman) (pasien #1) dalam jangka waktu antara tahun 2006 dan 2019. Semua pasien memberikan persetujuan tertulis yang diinformasikan, sampel diperoleh, dan penelitian dilakukan sesuai dengan Deklarasi Helsinki dan di bawah persetujuan Komite Etik Independen setempat (protokol 194/2010), Kementerian Kesehatan Italia dan Komite Etik fakultas kedokteran Universitas Rostock, sesuai dengan pedoman yang diterima secara umum untuk penggunaan material manusia. Organoid pasien #1 dan pasien #3 awalnya dibuat di laboratorium Prof. Bardelli dari model PDX (PDXO) sebagaimana dijelaskan sepenuhnya di [ [ 20 ] ]. Organoid pasien #2, pasien #4, dan pasien #5 dibuat langsung dari biopsi jaringan yang diperoleh pada saat pembedahan. Organoid dari pasien #2 dibuat di INGM (Istituto Nazionale Genetica Molecolare “Romeo ed Enrica Invernizzi”, Milan, Italia), sedangkan organoid dari pasien #4 dan #5 dibuat di Candiolo Cancer Institute. Organoid diproses dan diobati mengikuti protokol yang sebelumnya dijelaskan dalam [ [ 20 , 21 ] ]. Secara singkat, organoid disemai sebagai sel tunggal dengan kepadatan 4000 hingga 6000 sel per sumur dalam pelat 96 sumur yang dilapisi dengan ekstrak membran dasar (BME; Cultrex BME Tipe 2; Amsbio, Cambridge, MA, AS). Pengobatan dilakukan 4 hari setelah penyemaian, setelah organoid yang tumbuh terlihat. Konsentrasi obat yang ditunjukkan, D-3263 (1,5 μ m ) dan 5-Fluorouracil (0,5 μ m ) + Oxaliplatin (1 μ m ) ditambahkan secara otomatis oleh Tecan D300e Digital Dispenser dalam medium segar 150 μL yang mengandung 2% BME. Sebanyak 4 μmol/L MG-132 digunakan sebagai kontrol positif; DMSO berfungsi sebagai kontrol negatif. Viabilitas diuji pada akhir percobaan setelah 5 hari pengobatan dengan uji CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability (Promega, Madison, WI, AS) dengan modifikasi (detail lengkap dalam [ [ 21 ] ]). Hasil diperoleh dari dua percobaan biologi independen, masing-masing dengan enam replikasi teknis.
2.11 Statistik
Data dinyatakan sebagai rata-rata ± sd dari tiga replikasi biologis, kecuali dinyatakan lain. Analisis statistik dilakukan menggunakan GraphPad Prism 8.0, dengan ambang batas signifikansi ditetapkan pada <0,05.
3 Hasil
3.1 Pewarnaan imun TRPM8 mengungkapkan ekspresi saluran yang diremehkan pada karsinoma paru-paru, payudara, dan kolorektal manusia
Profil transkripsi gen TRPM8 berdasarkan kumpulan data RNAseq Cancer Genome Atlas mendefinisikan jaringan prostat dan, terlebih lagi, karsinoma prostat sebagai lokasi utama untuk ekspresi TRPM8 (Gbr. 1A ) [ [ 12 ] ]. Karsinoma hepatoseluler mengikuti, sementara semua tumor lainnya menunjukkan kadar RNA TRPM8 yang mendekati ambang deteksi di hampir keseluruhan sampel (Gbr. 1A ) [ [ 12 ] ]. Bukti eksperimental yang diperoleh selama beberapa tahun terakhir oleh kelompok kami sering menunjukkan dikotomi tajam antara kadar transkrip TRPM8 dan jumlah protein dalam lini sel prostat dan sampel manusia [ [ 12 , 14 ] ], meningkatkan keraguan tentang prediktabilitas ekspresi saluran TRPM8 berdasarkan kadar RNA-nya. Untuk menganalisis status saluran TRPM8 dalam sekelompok tumor padat selain kanker prostat, Tissue Microarray dibeli dari US Biomax, Inc. (MC2081a) dan diwarnai dengan antibodi tervalidasi terhadap TRPM8 (Alomone #ACC-049; [ [ 12 – 14 ] ]) di Unit Operatif Patologi Anatomi Rumah Sakit Santa Chiara Trento. Analisis buta oleh tiga ahli patologi berpengalaman (MB, FGC, GB) mendefinisikan saluran TRPM8 yang diekspresikan pada tingkat yang sangat rendah di paru-paru normal, payudara, dan epitel usus dengan peningkatan yang nyata pada tumor yang sesuai yang sering dikaitkan dengan stadium tumor (Gbr. 1B,C ). Khususnya, analisis komparatif inti karsinoma paru-paru, payudara, kolorektal, dan prostat yang dideteksi pada TMA yang sama menentukan kadar protein TRPM8 yang tinggi di inti yang berbeda dari keempat jenis tumor yang dianalisis (Gbr. 1B ; Tabel S1 , S2 ), terlepas dari ekspresi relatif RNA TRPM8 di antara mereka (Gbr. 1D ). Untuk menyelidiki lebih lanjut saluran TRPM8 pada tumor padat selain kanker prostat, jumlah RNA dan protein dipelajari dalam satu set tiga sampel prostat normal dan tumor yang cocok yang dikumpulkan dari pasien yang menjalani prostatektomi radikal dan lima sampel kanker kolorektal yang dikumpulkan dari pasien setelah reseksi segmental usus besar (Gbr. 1E–G ). Seperti yang diharapkan, baik RNA dan protein TRPM8 diekspresikan dalam jaringan prostat normal dan meningkat pada lesi neoplastik yang cocok (Gbr. 1E,G , Gbr. S1A ). Berbeda dengan data RNAseq yang menunjukkan tingkat RNA TRPM8 yang hampir tidak terdeteksi pada CRC (Gbr. 1A,D ), kelima sampel CRC dikarakterisasi oleh ekspresi RNA dan protein TRPM8, seperti yang juga ditunjukkan oleh studi imunohistokimia (Gbr. 1B) .). Perlu dicatat, pada kedua jenis tumor, jumlah relatif protein TRPM8 antara sampel tidak mencerminkan jumlah relatif RNA-nya dalam sampel yang sama.
Gbr. 1
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Ekspresi RNA dan protein TRPM8 pada kanker padat. (A) Lanskap tingkat transkrip TRPM8 pada sampel tumor primer di berbagai jaringan (sumbu horizontal) diambil dari kumpulan data The Cancer Genome Atlas (TCGA) dari cBioPortal. Kotak tampilan panel menggambarkan distribusi data; kotak mewakili rentang median dan interkuartil, sementara kumis menunjukkan variabilitas di luar kuartil, dengan titik data individual ditampilkan di atas plot. (B) Gambar representatif imunolokalisasi TRPM8 pada sampel jaringan prostat, kolorektal, payudara, dan paru-paru yang sehat dan ganas yang terlihat pada mikroarray jaringan komersial (TMA). Imunopewarnaan TRPM8 dinilai sebagai tidak ada (0), lemah (1), sedang (2) atau tinggi (3) (skala batang 20 μm). (C) Skor TRPM8 terkait dengan stadium tumor ( n = 48 inti per jenis kanker; n = 4 inti per jenis jaringan normal). (D) Perbandingan langsung ekspresi RNA TRPM8 pada kanker prostat, kolorektal, payudara, dan paru-paru. Kotak diagram tampilan panel yang mengilustrasikan distribusi data; kotak mewakili median dan rentang interkuartil, sementara kumis menunjukkan variabilitas di luar kuartil, dengan titik data individual ditampilkan di atas diagram. (E, F) Kuantifikasi ekspresi RNA TRPM8 dan jumlah protein dalam sampel jaringan prostat normal (N) dan kanker prostat (T) yang cocok yang diisolasi dari n = 3 prostatektomi radikal pasien kanker prostat (PCa) (E), dan n = 5 sampel kanker kolorektal (CRC) independen (F). (G) Western blot protein TRPM8 dalam sampel yang dijelaskan dalam (E, F).
Aktivasi 3.2 TRPM8 mengubah kemoterapi sub-mematikan menjadi pengobatan kanker yang efektif
Model lini sel klasik kanker kolorektal (CRC, HCT116), kanker payudara (BC, MCF7), dan kanker paru non-sel kecil (NSCLC, A549) dipilih untuk mempelajari ekspresi TRPM8 dan respons seluler terhadap pemberian agonis saluran D-3263, dibandingkan dengan lini sel kanker prostat (PCa) TRPM8-positif (VCaP dan LNCaP) dan TRPM8-negatif (PC3) yang banyak digunakan [ [ 12 ] ]. Analisis lini sel NCI-60 dan kumpulan data Cancer Cell Line Encyclopedia ([ [ 22 – 24 ] ]) menentukan jumlah RNA TRPM8 dalam HCT116, MCF7, dan A549 yang sebanding dengan sel kanker prostat PC3 dan DU-145 TRPM8-negatif (Gbr. 2A ). Studi RT-qPCR menunjukkan transkrip TRPM8 sedikit lebih banyak pada sel HCT116, MCF7, dan A549 dibandingkan dengan PC3, tetapi secara signifikan lebih sedikit (lima hingga sepuluh kali) dibandingkan dengan sel kanker prostat VCaP dan LNCaP positif TRPM8 (Gbr. 2B , Gbr . S1B ). Terlepas dari jumlah RNA, HCT116, MCF7, dan A549 mengekspresikan kadar protein TRPM8 yang berkisar antara yang diekspresikan dalam sel VCaP dan LNCaP (2 kali lebih banyak daripada VCaP, setengahnya dibandingkan dengan LNCaP; Gbr. 2C–F , Gbr. S1C ), yang telah terbukti sangat sensitif terhadap kombinasi dosis sub-letal dari pengobatan kanker standar ( misalnya , IR, HT, CT) dengan agonis TRPM8 poten WS-12 atau D-3263 [ [ 12 ] ]. Menariknya, studi terhadap lini sel melanoma SK-MEL5, G361, dan A375 lebih lanjut menunjukkan ketidakpastian ekspresi protein TRPM8 tergantung pada kadar transkripnya (Gbr. S1D ).
Gambar 2
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Jumlah saluran TRPM8 yang bervariasi dalam sel tumor dengan kadar rendah dari transkrip pengodeannya. (A) Ekspresi RNA TRPM8 dalam lini sel kanker yang dijelaskan dalam proyek-proyek lini sel NCI-60 dan Cancer Cell Lines Encyclopedia (diperoleh dari cBioPortal). (B) Analisis komparatif reaksi berantai polimerase transkripsi balik kuantitatif (RT-qPCR) dari ekspresi RNA TRPM8 dalam sel kanker prostat (VCaP, LNCaP, PC3), usus besar (HCT116), payudara (MCF7) dan paru-paru (A549). (C–F) Replika Western blot I dan II dari TRPM8 dalam lini sel VCaP, LNCaP, PC3, HCT116, MCF7, A549 dengan antibodi Alomone ACC-049 (C) dan Abcam Ab3243 (E), dan kuantifikasi relatif protein TRPM8 (D, F) dalam n = 4 replika independen yang ditunjukkan dalam C–E dan Gambar S2C . β-Actin digunakan sebagai kontrol pemuatan dan penormalisasi. Data disajikan sebagai rata-rata ± simpangan baku (sd) dari tiga (antibodi Alomone ACC-049) dan empat (antibodi Abcam Ab3243) percobaan independen. *** P ≤ 0,001, ** P ≤ 0,01, * P ≤ 0,05. Analisis statistik dilakukan menggunakan uji- t Student .
Protokol klinis mendefinisikan Docetaxel sebagai agen genotoksis standar untuk PCa, BC, dan NSCLC stadium lanjut, sementara CRC stadium lanjut sering diobati dengan FOLFOX, kombinasi 5-FU dan Oxaliplatin. Untuk menguji kemungkinan kontribusi aktivasi TRPM8 terhadap efikasi antitumor kemoterapi terpilih, sel LNCaP, MCF7, dan A549 diobati selama 12 dan 24 jam dengan dosis sub-letal Docetaxel (10 nM) atau agonis TRPM8 D-3263 (1 μ m ) sebagai agen tunggal atau dengan kombinasi keduanya. Sel HCT116 menerima dosis sub-letal 5-FU (10 μ m )/Oxaliplatin (2 μ m ), D-3263 (1 μ m ) atau WS-12 (1 μ m ) sebagai agen tunggal atau kombinasi ketiganya. Tak satu pun lini sel TRPM8-positif menunjukkan tanda kematian sel setelah 12 jam perawatan (Gbr. S2A ). Dua belas jam kemudian (24 jam perawatan), tidak ditemukan tanda-tanda toksisitas pada sel yang dirawat dengan D-3263 atau WS-12; Docetaxel menginduksi sedikit pembelahan hanya pada Caspase 3 pada LNCaP, MCF7, dan A549, sementara kombinasi kemoterapi dan D-3263 atau WS-12 memicu apoptosis terminal pada lebih dari 70% populasi pada semua lini sel (Gbr. 3A–C , Gbr. S2B,C , S3 , S4A ). Sel PC3 tanpa TRPM8, dan juga sel LNCaP, MCF7, A549, dan HCT116 dengan kadar TRPM8 yang diturunkan, refrakter terhadap kombinasi tersebut (Gbr. 3A–E , Gbr. S2B–G , S3 , S4A ).
Gambar 3
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Sinergi mematikan antara agonis TRPM8 D-3263 dan kemoterapi pada sel kanker. (A) Pewarnaan kristal violet representatif dari sel LNCaP, HCT116, MCF7, A549, dan PC3 yang tidak diobati atau diobati dengan obat yang diindikasikan selama 24 jam (kemoterapi = Docetaxel untuk LNCaP, MCF7, A549, dan PC3; 5-fluorouracil (5-FU + Oxaliplatin untuk HCT116). Knock-down TRPM8 (siRNA1 dan siRNA2) mengonfirmasi spesifisitas D-3263. (B) Kuantifikasi viabilitas sel yang diobati dibandingkan dengan kontrol yang tidak diobati. Data disajikan sebagai mean ± simpangan baku (sd) dari n = 3 eksperimen independen (A, Gambar S2C ). *** P < 0,001. Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan uji- t Student . (C, D) Analisis Western blot dari Caspase 3 dan pembelahan Parp pada LNCaP, HCT116, MCF7, A549, dan Sel PC3 yang tidak diobati atau diobati dengan obat yang diindikasikan selama 24 jam (C). Knock-down TRPM8 (siRNA2) mengonfirmasi spesifisitas D-3263 (D). (E) Perbandingan langsung kemanjuran D-3263 pada sel kanker tipe liar dan knock-down TRPM8 (KD). Analisis Western blot pada C–E diulang dengan n = 2 set sampel yang secara biologis independen.
Menurut literatur, TRPM2 adalah anggota subfamili TRPM yang paling dekat dengan TRPM8. Kedua saluran tersebut berbagi struktur dan permeabilitas yang sama terhadap ion kalsium; lebih jauh lagi, berdasarkan urutan asam amino mereka, sebagian besar residu kunci yang terlibat dalam pengikatan agonis dilestarikan [ [ 25 – 28 ] ]. Untuk menyelidiki spesifisitas penargetan D-3263 dari TRPM8 untuk respons sel kanker, kami membuat profil ekspresi saluran ion TRPM2 dalam lini sel kanker LNCaP, PC3, HCT116, MCF7, dan A549. Western blotting menunjukkan ekspresi TRPM2 yang sebanding dalam lini sel LNCaP, PC3, dan HCT116; sel A549 dicirikan oleh jumlah saluran TRPM2 yang sangat rendah, sedangkan saluran tersebut tidak terdeteksi dalam MCF7 (Gbr. S4B ). Ekspresi TRPM2 dalam sel PC3, yang tidak mengandung TRPM8 dan refrakter terhadap D-3263, dan ketidakhadirannya dalam sel MCF7, yang positif TRPM8 dan sensitif terhadap D-3263, menunjukkan bahwa TRPM2 tidak berperan dalam aktivitas D-3263. Sejalan dengan ini, pengurangan TRPM2 dalam sel kanker LNCaP dan HCT116 positif TRPM8 yang sensitif terhadap D-3263 tidak mengubah kemampuan D-3263 untuk meningkatkan aktivitas pembunuhan sel kanker dari kemoterapi standar (Gbr. S4C–F ).
3.3 D-3263 meningkatkan toksisitas 5-FU/oxaliplatin pada organoid CRC yang berasal dari pasien
Kanker kolorektal adalah tumor padat yang menunjukkan divergensi tertinggi antara ekspresi RNA dan protein TRPM8. Meskipun peningkatan jumlah TRPM8 pada tumor seharusnya meningkatkan kebugaran sel kanker melalui aktivasi jalur yang bergantung pada Ca 2+ , kami baru-baru ini menunjukkan hubungan erat RNA TRPM8 dengan imunitas anti-kanker [ [ 29 ] ]. Karena interaksi yang luas antara jaringan usus dengan sistem imun, kami memutuskan untuk mendapatkan pengetahuan tentang TRPM8 pada kanker kolorektal. Kami merakit TMA khusus yang memuat 80 inti independen yang mewakili berbagai stadium penyakit, masing-masing dipasangkan dengan inti dari jaringan normal yang berdekatan (Tabel S3 ). Potongan TMA diwarnai dengan dua antibodi spesifik independen terhadap TRPM8 (Alomone ACC-049 dan Abcam Ab3243) dan dianalisis oleh tiga ahli patologi berpengalaman (MB, FGC, GB). Analisis tersebut mengonfirmasi peningkatan jumlah saluran pada lesi kanker dibandingkan dengan jaringan sehat (Gbr. 4A,B , Gbr. S5 , Tabel S3 ), tanpa korelasi yang jelas antara jumlah TRPM8 dan stadium kanker.
Gambar 4
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Khasiat D-3263 + 5-FU + Oxaliplatin dalam organoid CRC meningkat seiring dengan jumlah TRPM8. (A) Imunolokalisasi TRPM8 dalam jaringan mikroarray (TMA) buatan sendiri khusus dari kanker kolorektal (skala batang 100 μm; ACC-049). Gambar representatif kanker kolorektal (CRC) dengan berbagai tingkat pewarnaan TRPM8 dan skor relatif. Skor 1: ekspresi lemah, skor 2: ekspresi sedang, skor 3: ekspresi tinggi. (B) Distribusi skor imunopewarnaan TRPM8 di seluruh spesimen kanker kolorektal (CRC) ( n = 79 inti independen). (C) Imunolokalisasi TRPM8 dalam n = 5 garis berbeda dari organoid kanker kolorektal (CRC) yang berasal dari pasien (skala batang 20 μm). (D) Western blot TRPM8 dari spesimen kanker kolorektal (CRC) ( n = 5 sampel independen) yang berasal dari bank jaringan Rumah Sakit Santa Chiara Trento dan—independen— n = 5 organoid yang berasal dari pasien (PDO). Analisis Western blot dalam D diulang dua kali. (E) Viabilitas relatif organoid kanker kolorektal (CRC) yang mengalami perawatan yang diindikasikan atau tidak diobati untuk dijadikan kontrol yang digabungkan berdasarkan jumlah protein TRPM8 (tinggi (Hi): PDO #1 dan PDO #4; rendah (Lo): PDO #2, PDO #3 dan PDO #5). Distribusi ukuran viabilitas di berbagai kondisi dan stratifikasi ditunjukkan menggunakan boxplot. Uji-t dua sampel berpasangan digunakan untuk membandingkan viabilitas garis organoid. Data disajikan sebagai mean ± simpangan baku (sd) dari dua eksperimen biologis independen, masing-masing dengan enam replikasi teknis.
Untuk mensimulasikan pendekatan yang memungkinkan dari onkologi presisi yang memanfaatkan penargetan TRPM8, lima garis organoid CRC yang berkarakterisasi dengan baik [ [ 20 , 21 ] ] didaftarkan dalam uji coba pra-klinis yang menguji D-3263 dan 5-FU/Oxaliplatin sebagai agen tunggal atau dalam kombinasi. Studi imunolokalisasi menunjukkan jumlah TRPM8 yang berbeda di kelima garis organoid (Gbr. 4C ). Western blotting mengonfirmasi heterogenitas ekspresi saluran antara garis organoid, tetapi juga menggarisbawahi ekspresi TRPM8 yang jauh lebih sedikit dalam organoid CRC dibandingkan dengan jaringan CRC yang tidak terkait yang berasal dari bank jaringan Rumah Sakit Santa Chiara di Trento (Gbr. 4D ). Mirip dengan garis sel, D-3263 tidak efektif ketika diberikan sebagai agen tunggal (Gbr. 4E ). Pengobatan dengan 5-FU dan Oxaliplatin sedikit mengurangi viabilitas tiga garis organoid CRC PDO #2, PDO #3, dan PDO #5 hingga ~10%, sedangkan garis PDO #1 dan PDO #4 melebihi 20%. Perlu dicatat, D-3263 bersinergi dengan 5-FU/Oxaliplatin dalam PDO #1 dan PDO #4 yang mengekspresikan jumlah TRPM8 yang lebih tinggi, sehingga efek kemoterapi tidak terpengaruh pada garis organoid dengan kadar saluran yang lebih rendah (Gbr. 4C–E ).
4 Diskusi
Profil genomik dan transkriptomik dari ribuan kanker manusia yang digabungkan dengan studi fungsional yang akurat telah secara substansial meningkatkan pengetahuan kita tentang biologi kanker dan secara signifikan meningkatkan pendekatan klinis terhadap berbagai bentuk tumor. Namun, kurangnya teknologi mutakhir yang memungkinkan karakterisasi mendalam proteom kanker dalam kelompok pasien yang luas mengecilkan penemuan mekanisme molekuler yang terlibat dalam tumorigenesis dan, pada gilirannya, lanskap strategi yang mungkin untuk mengalahkan kanker. Dalam daftar kontributor yang diremehkan untuk prognosis kanker, saluran ion berada di barisan depan. Jarang bermutasi, dihapus, atau diperkuat dalam kanker, deregulasi transkripsi mereka dalam lesi neoplastik dibandingkan dengan jaringan sehat umumnya biasa-biasa saja dan tidak cukup untuk meningkatkan minat yang mendalam dalam komunitas ilmiah. Penalaran yang terlalu disederhanakan ini dapat menyebabkan salah menilai relevansi klinis dari teka-teki mosaik yang tampaknya dapat diabaikan, yang sebaliknya dapat mewakili target onkologis yang berharga [ [ 12 – 14 , 18 , 30 ] ].
Ekspresi gen TRPM8 sangat mencirikan kompartemen luminal prostat normal. Hampir selalu, kadar RNA meningkat pada tumor primer dan metastasis yang sensitif terhadap hormon tetapi kemudian menurun secara signifikan pada tumor yang resistan terhadap pengebirian [ [ 12 – 14 ] ]. Jumlah protein TRPM8 sejajar dengan transkripnya dan meningkat pada tumor primer dan metastasis yang sensitif terhadap hormon sehubungan dengan sel tanpa tumor tetapi, secara tidak terduga, tetap diekspresikan dengan baik pada PCa yang resistan terhadap pengebirian [ [ 12 – 14 ] ]. Dikotomi antara kadar RNA dan jumlah protein TRPM8 juga terlihat jelas pada berbagai lini sel prostat, sehingga mendefinisikan deteksi protein sebagai metode yang lebih andal daripada profil RNA untuk mempelajari TRPM8. Konsisten dengan pengamatan ini, kami menunjukkan bahwa kanker payudara, paru-paru, dan kolorektal menunjukkan jumlah TRPM8 yang bervariasi terlepas dari tingkat RNA yang sangat rendah yang dilaporkan oleh kumpulan data RNAseq Cancer Genome Atlas (TCGA). Menurut data TCGA, ekspresi RNA TRPM8 dalam jaringan normal umumnya rendah (kecuali untuk jaringan prostat) dengan variabilitas minimal di antara sampel, yang secara konsisten mencerminkan jumlah saluran yang terdeteksi untuk IHC dalam epitel sehat, sehingga menunjukkan bahwa perbedaan RNA/TRPM8 mungkin merupakan peristiwa spesifik tumor daripada kondisi umum. Dalam lini sel kanker kolorektal, payudara, dan paru-paru yang banyak digunakan, saluran TRPM8 berfungsi dan stimulasi dengan agonis kuat D-3263 mendorong sitotoksisitas yang mematikan ketika dikombinasikan dengan dosis sub-mematikan dari agen kemo standar yang rutin digunakan di klinik untuk pengobatan penyakit stadium lanjut [ [ 31 ] ]. Identifikasi rute terapi baru yang meningkatkan prognosis kanker menyiratkan menemukan pengobatan dengan rasio efikasi/toksisitas yang dapat diterima. Percobaan knock-down di semua lini sel menentukan korelasi bersih antara kadar saluran dan kemanjuran D-3263, seperti yang sebelumnya juga ditunjukkan untuk lini sel prostat yang diobati dengan agonis TRPM8 yang berbeda (WS-12, [ [ 12 ] ]). Jumlah protein TRPM8 yang berkurang dalam jaringan normal dengan demikian dapat membenarkan toksisitas yang dapat diabaikan yang dijelaskan pada tikus dan manusia yang diobati dengan D-3263 [ [ 32 , 33 ] ]. Perlu dicatat, Dendreon Pharmaceuticals pada tahun 2009 memelopori uji klinis Fase I intervensional kecil (NCT00839631) yang mendaftarkan pasien kanker yang didiagnosis dengan berbagai jenis tumor padat lanjut (kanker prostat, usus besar, payudara, dan paru-paru, antara lain) untuk menguji D-3263. Efek sampingnya terbatas pada sensasi dingin, sementara tiga kanker prostat lanjut menunjukkan tanda-tanda stabilisasi penyakit [ [ 33 ]]. Temuan-temuan ini mendukung relevansi yang mungkin dimiliki penargetan TRPM8 dalam onkologi, khususnya untuk pengobatan tumor-tumor yang, melalui imunohistokimia, mengekspresikan kadar tinggi saluran tersebut. Demonstrasi formal bahwa D-3263 bekerja dalam model garis sel tikus TRAMP-C1 dan C2 dari PCa [ [ 14 ] ] membuka jalan bagi uji coba pra-klinis in vivo pada tikus C57BL/6 singeneik imuno-kompeten yang ditransplantasi secara orthotopik. Karakterisasi serupa dari ekspresi dan fungsi Trpm8 pada tikus C57BL/6 MC-38 dan BALB/c CT-26 sedang berlangsung dan berpotensi memperluas platform pra-klinis in vivo kami ke kanker kolorektal. Di sisi lain, kemampuan untuk mempelajari jumlah TRPM8 dengan cepat dan kontribusi terhadap terapi agonis saluran dalam organoid tumor yang berasal dari pasien secara sempurna memenuhi prinsip-prinsip onkologi presisi berdasarkan strategi koklinis [ [ 34 – 38 ] ].
Dari perspektif mekanistik, aktivasi TRPM8 dalam sel yang dicirikan oleh ekspresi saluran yang lebih tinggi diharapkan untuk mendorong arus kalsium masuk dengan konsekuensi pengosongan simpanan Ca 2+ intraseluler dan, akhirnya, sitotoksisitas kalsium [ [ 12 ] ]. Namun, percobaan yang bertujuan untuk mendeteksi dan mengukur Ca 2+ sitosol bebas melalui pewarna fluoresensi rasiometrik Fura-2 sering terbukti tidak meyakinkan dalam sel kanker yang diobati dengan WS-12 dan D-3263 [ [ 12 , 14 ] ]. Protein bioluminescent peka kalsium Aequorin dapat membantu mengevaluasi dengan hati-hati fluks Ca 2+ pada tingkat kompartemen subseluler tertentu [ [ 39 , 40 ] ]. Perlu dicatat, penelitian ini tidak mencakup pengobatan sel kanker secara bersamaan dengan terapi, yang mungkin malah mengintegrasikan tindakan TRPM8 dan meningkatkan pengosongan simpanan Ca 2+ intraseluler . Meskipun kalsium tetap menjadi tersangka utama, kita tidak dapat mengesampingkan kemungkinan bahwa sitotoksisitas yang dikaitkan dengan agonis saluran poten mungkin bergantung pada deregulasi homeostasis Na 2+ dan K + yang juga dapat ditembus TRPM8.
5 Kesimpulan
Secara keseluruhan, karya ini menunjukkan sinergi mematikan agonis TRPM8 dan kemoterapi standar dalam empat pembunuh utama di antara kanker manusia, menyoroti pentingnya saluran ion sebagai target molekuler untuk onkologi presisi.
