Abstrak
Biomanufaktur Kontinu Terpadu mengurangi biaya produksi sambil mempertahankan kualitas produk. Salah satu kontributor utama tingginya biaya biofarmasi, khususnya antibodi monoklonal (mAb), adalah kromatografi. Ligand Protein A biasanya lebih disukai tetapi masih mahal dalam konteks produksi, dan kromatografi batch kurang memanfaatkan kapasitas kolom, sehingga mengorbankan produktivitas untuk mempertahankan hasil yang tinggi. Kromatografi kontinyu meningkatkan Pemanfaatan Kapasitas (CU) kolom tanpa mengorbankan hasil atau produktivitas. Karya ini menyajikan optimasi in-silico dari Kromatografi Arus Balik Periodik 3 Kolom (3C-PCC) dari langkah penangkapan dan pemolesan untuk mAb dari panen titer tinggi (c mAb = 5 g/L). 3C-PCC dimodelkan dan Pareto-front untuk mode kontinu dan batch digunakan untuk mengoptimalkan langkah-langkah 3C-PCC dengan memvariasikan laju alir dan persentase terobosan yang dicapai dalam pemuatan yang saling berhubungan, memaksimalkan Produktivitas dan CU, untuk memvariasikan konsentrasi mAb (konsentrasi mode batch 5 g/L dan konsentrasi mode kontinu 2,5, 5, 7,5, dan 10 g/L). Bentuk kurva terobosan berdampak signifikan terhadap pengoptimalan 3C-PCC. Keluaran model divalidasi untuk tiga ligan protein A yang berbeda menggunakan larutan mAb murni. MAb Select SuRe pcc dipilih untuk terus menangkap mAb dari supernatan kultur sel yang dijernihkan dengan titer tinggi (panen). Eluat produk digabungkan dan digunakan untuk pemolesan berkelanjutan menggunakan resin Penukar Kation (CaptoS ImpAct). Hasil eksperimen memvalidasi prediksi model (<7% deviasi dalam kasus terburuk) dan proses dengan dua 3C-PCC secara berurutan diusulkan, dengan produktivitas sekitar 100 mg/mL res/jam.
Singkatan
%S
persentase terobosan yang dicapai di kolom pertama ketika dua kolom saling berhubungan
3C-PCC
Kromatografi arus balik periodik 3 kolom
mata uang kripto
kurva terobosan
Bahasa Indonesia: CEX
pertukaran kation
KU
pemanfaatan kapasitas
Bahasa Inggris DBC
kapasitas pengikatan dinamis
DSP
pemrosesan hilir
Dokter Spesialis
protein sel inang
KPI
indikator kinerja utama
Bahasa Inggris
antibodi monoklonal
Perahu
Protein A
Bahasa Inggris: USP
pemrosesan hulu
kamu
menghasilkan
1. PENDAHULUAN
Permintaan untuk antibodi monoklonal (mAb) meningkat setiap tahun, menjadikannya salah satu segmen produk yang tumbuh paling cepat dalam industri biofarmasi. 1 , 2 Secara bersamaan, mAb secara historis mahal untuk diproduksi, dan alternatif yang terjangkau diperlukan, dengan berakhirnya paten mendorong pengurangan biaya, sebagian besar dalam bentuk biosimilar. 3 Strategi operasional dan perbaikan proses juga telah diterapkan untuk meningkatkan kapasitas produksi, terutama perkembangan terkini dalam Pemrosesan Hulu (USP) di mana titer yang semakin tinggi dicapai. 4 Tentu saja, perbaikan USP pada produktivitas lini sel dengan peningkatan biaya yang lebih sedikit telah mengalihkan tekanan biaya biofarmasi ini ke Pemrosesan Hilir (DSP), di mana biayanya bisa mencapai 80% dari total biaya produksi. 5 Dari semua operasi unit dalam rangkaian DSP, kromatografi adalah yang paling menuntut biaya. Hal ini terutama disebabkan oleh resin yang mahal (terutama ligan protein A) dan fakta bahwa biasanya ada tiga langkah kromatografi. 6 , 7 Meskipun demikian, spesifisitas dan ketahanan kromatografi masih menjadikannya pilihan yang paling layak untuk pemurnian mAb, karena alternatif lain masih belum mampu bersaing dengannya. 8 – 10
Biomanufaktur Kontinu Terpadu dapat membantu mengatasi masalah-masalah yang disebutkan di atas dengan meningkatkan produktivitas dan mengurangi biaya seluruh proses. 11 Komunitas biofarmasi dan badan-badan regulasi bekerja sama untuk melakukan transisi ke manufaktur berkelanjutan. 12 , 13 Kromatografi, dalam kebanyakan kasus, pada dasarnya merupakan proses batch. Jika dioperasikan dalam mode bind dan elute, pengumpulan produk mau tidak mau akan bersifat diskrit. Berbagai strategi untuk mengubah kromatografi batch menjadi berkelanjutan telah diusulkan: (Capture) Simulated Moving Bed (CaptureSMB/SMB) dalam kasus pengoperasian dalam mode bind dan elute atau tidak, masing-masing 14 ; Pemurnian Gradien Pelarut Arus Balik Multikolom (MCSGP) 15 ; Kromatografi Arus Balik Periodik (PCC); antara lain 14 ; dan berbagai sistem telah tersedia secara komersial. 16
Proses PCC memungkinkan pemuatan produk secara terus-menerus ke dalam kolom sementara memulihkannya secara bersamaan. Ini dicapai dengan menghubungkan kolom-kolom selama fase pemuatan sambil melakukan langkah-langkah non-pemuatan di kolom-kolom lain. 17 Kurva Terobosan (BTC), yang penting untuk desain proses kromatografi dalam mode bind dan elute, memberikan informasi tentang Kapasitas Pengikatan Dinamis (DBC) protein pada kondisi operasi tertentu (laju aliran, kondisi buffer, dll.). Gambar 1a menunjukkan BTC yang khas dan mengilustrasikan bagaimana kromatografi batch biasanya dimuat hingga 1% dari DBC (DBC 1% ). Area berwarna hijau muda di atas kurva BTC menunjukkan protein yang diserap ke resin hingga DBC 1% , sedangkan area abu-abu dengan garis diagonal kanan dan area merah dengan garis diagonal kiri mewakili protein yang akan hilang dan apa yang masih dapat diserap ke kolom jika kolom akan dimuat ke DBC 100% , masing-masing. Pada Gambar 1b dapat dilihat bahwa dengan menghubungkan dua kolom selama pemuatan, adalah mungkin untuk mencapai DBC yang lebih tinggi tanpa kehilangan produk, yang (ditangkap oleh kolom berikutnya, diwakili oleh area putih). Pada kolom di posisi pertama, lebih banyak protein akan diserap (jumlah area hijau muda dan hijau tua). Pengurangan area merah berarti lebih banyak resin digunakan untuk menyerap produk, meningkatkan pemanfaatan resin. Menghubungkan kolom selama fase pemuatan memungkinkan peningkatan Pemanfaatan Kapasitas (CU) kolom dan meningkatkan produktivitas, yang mengarah pada volume kolom yang lebih rendah yang dibutuhkan, mengurangi biaya resin relatif. Volume kolom yang lebih rendah akibatnya akan mengurangi jumlah buffer yang dibutuhkan per gram produk, berkontribusi pada pengurangan biaya yang terkait dengan buffer dalam proses pembuatan mAb.
GAMBAR 1
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Kurva terobosan yang penting untuk desain kromatografi kontinu. C/C0 , konsentrasi protein yang menembus kolom dibagi dengan konsentrasi umpan; CV, volume kolom. (a) Skenario di mana hanya satu kolom yang terhubung; (b) Skenario di mana kolom-kolom saling berhubungan. Hijau muda menunjukkan protein yang diserap ke resin kromatografi hingga 1% dari DBC; Hijau tua menunjukkan protein yang diserap di kolom i hingga persentase terobosan tertentu tercapai (diwakili oleh %s ). Merah dengan garis miring diagonal kiri menunjukkan protein yang masih dapat diserap ke kolom jika pemuatan hingga 100% DBC dipilih. Abu-abu dengan garis miring diagonal kanan sesuai dengan protein dalam aliran. Putih menunjukkan apa yang menerobos di kolom i ke kolom i + 1 dalam fase pemuatan yang saling berhubungan.
Studi optimasi empiris pada PCC dapat melelahkan dan mahal, karena diperlukan sejumlah besar produk dan waktu untuk menemukan proses yang optimal. Dengan menggunakan Model Mekanistik untuk menggambarkan perilaku kromatografi, beberapa skenario dapat diuji secara in silico sebelum harus beralih ke laboratorium. 18 Ada beberapa parameter yang perlu ditangani dalam optimasi tersebut, 19 oleh karena itu optimasi berbasis komputer akan membantu mengurangi waktu pengembangan proses. Pilihan model dan kerangka optimasi penting, karena sering kali ada kompromi antara akurasi dan waktu optimasi. Lebih jauh, kelayakan berbagai alternatif proses dapat dievaluasi secara in silico , sehingga menghemat waktu dan sampel. 20
Chen et al. mengusulkan korelasi linear antara DBC % dan kelompok tanpa dimensi yang memuat banyak parameter kromatografi. Pendekatan seperti itu melewati kebutuhan untuk menggunakan model tetapi dapat menyebabkan kesalahan yang lebih besar tergantung pada resin yang dipelajari. 21 Kelompok Profesor Dong-Lin telah menghasilkan karya dalam optimasi berbasis model untuk penangkapan antibodi monoklonal menggunakan kromatografi kolom kembar 22 , 23 dan 3C-PCC. 19 Para penulis menyimpulkan bahwa pendekatan dua kolom sering kali memerlukan pilihan laju aliran yang lebih cermat, yang mengarah pada proses dengan produktivitas (biasanya) lebih rendah dibandingkan dengan 3C-PCC. 4C-PCC juga merupakan platform yang menarik untuk pengaturan sistem kromatografi kontinu. Meskipun mewakili investasi yang lebih tinggi dalam peralatan (rumah kolom dan katup), ia menyediakan fleksibilitas operasional yang lebih besar daripada 3C-PCC, yang memungkinkan lebih banyak waktu untuk langkah-langkah non-pemuatan. Baru-baru ini, penulis yang sama mengembangkan strategi bebas model untuk pengembangan proses 3C -PCC di mana pengaruh banyak parameter pada produktivitas proses dievaluasi.24 Meskipun pendekatan ini mungkin tampak menarik karena menyediakan studi komputasi, pendekatan ini dapat mengarah pada pengembangan proses yang kurang akurat disertai dengan upaya eksperimental yang lebih besar.
Sementara pekerjaan yang disebutkan sebelumnya memberikan wawasan ke dalam pengembangan proses berbasis model dan optimasi untuk kromatografi kontinu, sebagian besar pekerjaan difokuskan pada titer yang relatif rendah (misalnya, 2-3 g/L). 20 , 21 Karena industri melihat peningkatan titer di hulu, sangat penting untuk mengatasi peningkatan titer ini dan menerapkan kondisi tersebut dalam pendekatan optimasi. Oleh karena itu, pekerjaan ini menyajikan optimasi berbasis model untuk batch dan langkah penangkapan Protein A (ProA) 3C-PCC dan langkah Pertukaran Kation pemolesan (CEX) 3C-PCC dari panen titer tinggi (c mAb = 5 g/L). Resin yang dipilih dioptimalkan secara in-silico untuk konsentrasi umpan yang berbeda, dan model kontinu divalidasi dengan larutan mAb murni. Resin ProA dengan kinerja terbaik dipilih untuk penelitian dengan larutan panen, dan eluat digunakan sebagai larutan umpan untuk 3C-PCC CEX setelah menjalani inaktivasi virus batch (VI), meniru langkah penangkapan dan pemolesan kontinu. Terakhir, data model dibandingkan dengan data eksperimen untuk menilai kelayakan model dalam menggambarkan sistem dan akurasinya.
2 BAHAN DAN METODE
2.1 Model dan optimasi kromatografi
2.1.1 Proses dan model 3C-PCC
3C-PCC dimodelkan menggunakan Model Dispersi Transportasi, dan perpindahan massa dijelaskan oleh model Solid-Film Linear Driving Force (menggunakan isoterm Langmuir), keduanya dijelaskan di tempat lain. 25 eksperimen BTC yang digunakan untuk mengkalibrasi model tersebut sebelumnya telah dijelaskan dan dilakukan (untuk resin ProA). 25 eksperimen BTC untuk resin CEX ditunjukkan dalam SI (Gambar SI 5 ). Data isoterm untuk resin ProA dan CEX telah dipublikasikan di tempat lain. 25
Seperti dalam kasus pengaturan eksperimen, model menghubungkan outlet satu kolom ke kolom lain (untuk pemuatan interkoneksi dan pencucian interkoneksi), yang dalam model dicapai dengan menetapkan kondisi batas masuk kolom penerima sebagai outlet kolom di hulu. Dalam sistem ini, kondisi batas Danckwerts untuk sistem dispersif berlaku, 26 di mana konsentrasi masuk disediakan oleh solusi matematis kolom sebelumnya. Ini dilakukan dalam sistem aksial dan bergantung waktu persamaan diferensial biasa (ODE), dan diskritisasi spasial dicapai dengan menggunakan metode garis. Selama pemuatan interkoneksi, produk dalam terobosan kolom i diserap dalam kolom i + 1 , sedangkan selama pencucian interkoneksi, produk yang dicuci dari kolom pada posisi i diserap dalam kolom i + 2. Skema operasi diberikan dalam Gambar SI 1. Langkah pemuatan bervariasi tergantung pada optimasi, sedangkan langkah non-pemuatan pencucian, elusi, CIP, dan penyeimbangan tetap. Ini masing-masing adalah 8, 7, 6, dan 5 CV, dan dipilih berdasarkan rekomendasi produsen resin dan pengalaman sebelumnya.
2.1.2 Optimasi batch dan berkelanjutan
Dalam proses PCC, kontinuitas umpan dipastikan dengan menjamin bahwa waktu yang dibutuhkan untuk memuat satu kolom secara penuh ( siklus t ) lebih besar daripada waktu yang dibutuhkan untuk melakukan semua langkah lainnya. 17 Dua indikator kinerja umum adalah produktivitas (P), yang merupakan protein yang diserap per volume resin dan waktu, dan pemanfaatan kapasitas (CU), yang merupakan produk yang diserap secara efektif dibagi dengan produk maksimum yang dapat diserap pada konsentrasi umpan yang diuji dan bergantung pada isoterm. Indikator dihitung menurut persamaan berikut:
Di manamathematical equationadalah waktu siklus untuk semua siklus,mathematical equationadalah konsentrasi umpan,mathematical equationadalah laju aliran muatan,mathematical equationadalah massa yang hilang dalam siklus (didefinisikan sebagai total massa yang tidak diserap dalam semua siklus), V c adalah volume kolom, L adalah panjang kolom,mathematical equationadalah porositas lapisan, N kolom adalah jumlah kolom, N siklus adalah jumlah siklus, danmathematical equationDanmathematical equationadalah kapasitas adsorpsi maksimum dan konstanta kesetimbangan adsorpsi setiap resin, masing-masing dalam model Langmuir.
Untuk proses yang ditentukan, batasan Yield (Y) ditetapkan untuk meminimalkan kehilangan produk baik pada langkah pemuatan yang saling berhubungan (dengan terobosan awal pada kolom kedua) maupun pada langkah pencucian yang saling berhubungan. Hal ini dapat didefinisikan sebagai produk yang dipulihkan dibagi dengan total produk yang dimuat:
Selain itu, ada parameter lain yang dapat digunakan untuk merancang langkah PCC dan mengevaluasi kinerjanya, yaitu persentase terobosan yang dicapai pada kolom pertama ketika dua kolom saling terhubung ( %s ). Hal ini dapat didefinisikan sebagai:
Variabel desain untuk optimasi langkah kontinyu adalah laju aliran pemuatan dan %s . Kendala yang ditetapkan untuk sistem adalah kontinuitas umpan (berarti bahwa siklus t harus lebih besar daripada waktu untuk memulihkan produk dan menyiapkan kolom yang akan dihubungkan untuk pencucian ( tRR )), dan kendala hasil, untuk menghindari kehilangan produk. Variabel desain untuk optimasi langkah kontinyu adalah laju aliran pemuatan dan %s . Namun, karena %s ditetapkan menjadi 1% karena kendala hasil, satu- satunya variabel desain untuk optimasi kromatografi batch adalah laju aliran pemuatan. Prosedur optimasi untuk langkah kontinyu dapat diringkas dalam:
Batas bawah darimathematical equationadalah 0,1 dan 0,25 mL/menit untuk optimasi PCC CEX dan ProA, masing-masing. Dalam kasus di mana solusi optimal dari fungsi objektif secara negatif mempengaruhi hasil yang lain, front Pareto menemukan solusi non-inferior untuk masalah tersebut, yang membentuk front Pareto. Optimasi dijalankan untuk setiap resin dan konsentrasi umpan yang berbeda (2,5, 5, 7,5, dan 10 g/L untuk resin ProA dan 5, 10, 15, dan 20 g/L untuk resin CEX). Pemecah optimasi yang digunakan adalah paretosearch , fungsi bawaan dari Global optimization toolbox di MATLAB, yang dapat memecahkan masalah optimasi multi-objektif yang dibatasi. Pemecah lain ( gamultiobj ) juga diuji, tetapi hasil yang dihasilkan sama. Karena algoritma paretosearch memperoleh hasil yang sama dan memakan waktu sekitar 20% dari waktu algoritma gamultiobj , yang pertama dipilih untuk pekerjaan saat ini. Ukuran set Pareto yang dipilih adalah 150, iterasi maksimum 50, dan toleransi default digunakan (1e-6). Setiap optimasi dihitung secara paralel dalam komputer 10-inti dan dijalankan selama sekitar 18 jam masing-masing.
2.2 Bahan
Kolom HiTrap® 1 mL dari resin ProA Mab Select SuRe (MSS), Mab Select PrismA (MSPrismA), dan Mab Select SuRe pcc (MSSpcc) serta resin CEX Capto™ S ImpAct (CaptoS Imp) dan SP Sepharose Fast Flow (SP Seph FF) dibeli dari Cytiva, Uppsala, Swedia. Tinggi bed adalah 25 mm, diameter dalam 7 mm, dan volume bed 1 mL. mAb (M w 148.220 Da, pI ≈ 8,6) yang digunakan dalam penelitian ini disediakan oleh Byondis BV, Nijmegen, Belanda, baik dalam bentuk murni maupun dengan Kultur Sel yang Dijernihkan (panen). Titer mAb yang ada dalam panen adalah 1,4 g/L, ditentukan oleh Kromatografi Protein-A Analitik oleh pemasok.
2.3 Persiapan buffer dan larutan
Berbagai buffer dan larutan disiapkan dengan melarutkan sejumlah bahan kimia yang sesuai dalam air Milli-Q. Untuk studi resin ProA, buffer 1× Phosphate Buffer Saline (PBS) disiapkan, dan pH disesuaikan menjadi 7,14 untuk semua percobaan guna meniru nilai pH larutan panen. Untuk studi resin CEX, larutan NaOAc 25 mM pada pH 4,5 disiapkan. Buffer elusi yang digunakan untuk resin ProA dan CEX masing-masing adalah NaOAc 25 mM pH 3,5 dan NaOAc 25 mM dengan NaCl 1 M pH 4,5. mAb yang disediakan dalam bentuk murni dipertukarkan dengan buffer ke dalam larutan buffer yang disebutkan di atas menggunakan metode yang dijelaskan di tempat lain 25 (tergantung pada resin yang dipelajari) dan diencerkan hingga konsentrasi yang diinginkan. Larutan mAb yang sangat pekat dalam buffer 1× PBS (c mAb = 12 − 15 g/L, bergantung pada larutan yang disiapkan) digunakan untuk meningkatkan konsentrasi mAb dalam panen dari 1,4 menjadi 5 g/L.
2.4 Metode Analisis
Konsentrasi, kandungan agregat, dan kemurnian eluat sampel panen ditentukan dengan kromatografi pengecualian ukuran analitis (SEC) menggunakan Sistem UltiMate 3000 UHPLC (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). 5 μL dari setiap sampel disuntikkan ke dalam kolom ACQUITY UPLC Protein BEH SEC 200 Å (Waters Corp., Milford, MA), menggunakan buffer berjalan 100 mM buffer natrium fosfat pH 6,8, laju alir 0,3 mL/menit, dan absorbansi 280 nm. Konsentrasi protein yang diperkirakan dengan pengukuran UV daring dalam penelitian dengan mAb murni dalam sistem ÄKTA ditentukan menggunakan kurva kalibrasi yang sesuai yang diperoleh menggunakan sistem ÄKTA, yang linier hingga 5 g/L.
2.5 Kriteria pemilihan resin
Pemilihan resin ProA dan CEX didasarkan pada penelitian sebelumnya. 25 Tiga resin ProA (MSS, MSPrismA, dan MSSpcc) dipilih karena kapasitas pengikatan maksimum, konstanta afinitas, dan stabilitasnya. Studi optimasi menentukan kondisi operasi untuk eksperimen mAb PCC, yang menargetkan produktivitas 100 mg/mL resin/jam. Resin ProA dengan kinerja eksperimen terbaik dalam hal produktivitas dan CU digunakan untuk PCC dengan Harvest. Dua resin CEX dipilih dari kumpulan 16 berdasarkan kriteria yang sama dengan ProA (kapasitas pengikatan maksimum, konstanta afinitas, dan stabilitas), dan mempertimbangkan bahwa pengujian awal telah menunjukkan pembersihan HCP yang besar yang diperoleh setelah ProA dan jumlah agregat yang dihasilkan rendah (data tidak ditampilkan). Profil BTC menunjukkan kesesuaian untuk sistem 3C-PCC.
2.6 Pengujian berkelanjutan—mAb murni dan panen
Untuk percobaan penangkapan, konsentrasi mAb 5 g/L dipilih, dan proses dijalankan selama total 8 siklus. Percobaan 3C-PCC dengan mAb murni digunakan untuk memvalidasi hasil model dan membandingkan kinerja resin. Resin dengan kinerja terbaik dalam hal kriteria pemilihan digunakan untuk langkah penangkapan dari campuran Harvest, pada konsentrasi mAb 5 g/L.
Eluat tahap penangkapan dari uji panen disimpan dalam buffer elusi selama minimal 1 jam untuk mensimulasikan VI, kemudian dicampur, dan pH dikoreksi menjadi 4,5. Larutan ini kemudian digunakan sebagai masukan untuk pengujian 3C-PCC resin CEX. Karena kemampuan kromatografi untuk berkonsentrasi, larutan yang tersedia untuk uji CEX memungkinkan pengujian sebanyak 4 siklus, bukan 8 siklus untuk resin ProA.
2.7 Pengaturan eksperimen berkelanjutan dan kontrol proses
Pengaturan eksperimen untuk 3C-PCC runs (mAb murni dan kontinyu) ditunjukkan pada Gambar 2. Pengaturan ini mirip dengan yang digunakan oleh Gomis-Fons et al., yang diaplikasikan pada unit ÄKTA Avant 25. 20 Katup kolom (ColV) digunakan untuk menentukan jalur aliran pemuatan sampel (garis hijau). Katup serbaguna (VV) dan katup keluar (OutV) digunakan untuk mengarahkan aliran setelah setiap kolom. Pada Gambar 2 , C1 dan C2 berada dalam fase pemuatan yang saling berhubungan, sedangkan C3 menjalani langkah-langkah non-pemuatan (garis biru). Monitor UV1 digunakan untuk memantau fase pemuatan dan pencucian pada setiap kolom, dan monitor UV2 digunakan untuk memantau langkah-langkah elusi dan apa yang meninggalkan kolom pada posisi i + 1 pada langkah pencucian yang saling berhubungan, keduanya mengukur absorbansi pada 280 nm. Terakhir, katup loop (LV) digunakan untuk memfraksinasi eluat setiap kali pengumpulan aktif. Sistem kromatografi dikontrol oleh perangkat lunak penelitian Orbit, 27 yang sebelumnya digunakan untuk kontrol dan pemantauan proses pemurnian berkelanjutan. 28
GAMBAR 2
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Pengaturan eksperimen proses 3C-PCC pada ÄKTA Avant 25. Contoh menunjukkan pemuatan yang saling berhubungan dari kolom 1 ke kolom 2 (garis hijau) sementara kolom 3 mengalami langkah-langkah non-pemuatan (garis biru) (dalam kasus ini langkah elusi, tempat pengumpulan produk).
2.8 Analisis statistik
Ketidakpastian yang dilaporkan dihitung dengan mempertimbangkan kesalahan sistematis dan kesalahan statistik yang diakibatkan oleh variasi acak dari nilai yang diukur. Simpangan baku sampel dan penyebaran kesalahan dihitung menurut Young. 29 Untuk kesalahan sistematis, hanya ketidakpastian yang terkait dengan regresi parameter kalibrasi yang diperhitungkan, karena kesalahan peralatan lainnya jauh lebih kecil dan dengan demikian dapat diabaikan.
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1 Optimasi PCC—Protein A
Optimalisasi ProA 3C-PCC dicapai dengan memperkirakan front Pareto untuk Produktivitas dan CU. Front Pareto dapat dihitung untuk kombinasi apa pun dari Indikator Kinerja Utama (KPI), yang dapat berupa Kemurnian, Hasil, CU, faktor konsentrasi, dan Produktivitas, antara lain. 20 , 30 Dalam kasus pekerjaan saat ini, Hasil digunakan sebagai kendala dan Produktivitas dan CU dianggap sebagai KPI yang lebih penting untuk dioptimalkan, karena diharapkan kemurnian akan tinggi setelah langkah ProA. Optimalisasi dilakukan untuk tiga resin yang berbeda, pada empat konsentrasi umpan yang berbeda untuk sistem 3C-PCC dan satu konsentrasi umpan untuk sistem batch.
3.2 Pengaruh konsentrasi antibodi
Optimasi sistem 3C-PCC dilakukan pada konsentrasi 2, 5, 7,5, dan 10 g/L. Karena titer tinggi menjadi lebih umum di USP 1 , sangat penting bagi DSP untuk mempersiapkan peningkatan di masa mendatang. Saat ini, 2 g/L adalah standar, dan 5 g/L menjadi lebih umum, sementara 10 g/L jarang tetapi telah dilaporkan. 31 , 32 Untuk operasi berkelanjutan, WuXi Biologics telah melaporkan produktivitas hulu hingga 2,5 g/L/hari. Untuk dapat beroperasi di bawah kontinuitas umpan, ada trade-off antara konsentrasi beban dan laju aliran. Ini karena perlu ada cukup waktu yang dialokasikan untuk langkah-langkah non-pemuatan, yang terjadi selama beban yang saling berhubungan. Hanya mungkin untuk merancang langkah 3C-PCC secara efisien ketika memperhitungkan hal ini.
Model dikalibrasi pada laju alir yang bervariasi dengan konsentrasi umpan 5 g/L yang konstan, yang memerlukan ekstrapolasi untuk konsentrasi yang lebih tinggi. Meskipun perlu verifikasi eksperimental, korelasi linier antara koefisien perpindahan massa dan konsentrasi umpan diharapkan berlaku untuk konsentrasi yang lebih tinggi, sehingga hasil ekstrapolasi dapat diandalkan. Jika konsentrasi umpan menjadi semakin tinggi (di atas 10 g/L), validasi korelasi ini diperlukan, karena dapat berdampak pada strategi kontrol langkah pemuatan dan elusi. 33 Gambar 3 menunjukkan front Pareto untuk resin ProA yang berbeda (MSS, MSPrismA, MSSpcc). Bentuk front ini dipengaruhi oleh profil BTC resin dalam berbagai kondisi. Laju alir yang lebih tinggi meningkatkan produktivitas dengan memproses lebih banyak produk dalam waktu yang sama tetapi meratakan BTC, memperpendek fase pemuatan yang terputus. Hal ini dapat menyebabkan terobosan di kolom kedua sebelum kolom pertama mencapai %s yang diperlukan, yang memengaruhi CU. Hal ini terutama terlihat pada konsentrasi yang lebih rendah (2 dan 5 g/L) dan untuk MSS, yang memiliki kapasitas terendah dan paling terpengaruh secara negatif oleh peningkatan laju aliran. Lebih jauh, front Pareto tampaknya tidak sepenuhnya mulus. Hal ini merupakan konsekuensi dari toleransi yang dipilih untuk pengoptimalan, di mana keseimbangan antara akurasi dan kecepatan komputasi dipilih. Untuk lebih memperhalus front Pareto, disarankan agar toleransi alat pengoptimalan dikurangi.
GAMBAR 3
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Plot optimasi dari tiga resin Protein A yang berbeda dipelajari untuk langkah penangkapan mAb. (a), (b), dan (c) adalah front Pareto untuk MSS, MSPrismA, dan MSSpcc, berturut-turut. Optimasi dilakukan untuk mode batch (pada c mAb 5 g/L) dan mode kontinyu (pada c mAb 2,5, 5, 7,5, dan 10 g/L). Angka 1, 3, 4, dan 5 menunjukkan hasil untuk mode kontinyu pada c mAb 2,5, 5, 7,5, dan 10 g/L, berturut-turut; angka 2 menunjukkan hasil untuk mode batch pada c mAb 5 g/L. (d) Perbandingan optimasi untuk kromatografi kontinyu dari tiga resin yang berbeda pada konsentrasi mAb 5 g/L. Konsentrasi 7,5 dan 10 g/L menunjukkan ekstrapolasi konsentrasi umpan untuk kalibrasi model.
MSSpcc, yang dirancang untuk meningkatkan perpindahan massa, 34 menunjukkan variasi paling sedikit pada front Pareto di seluruh konsentrasi. Ia mempertahankan BTC yang lebih tajam dan CU yang lebih tinggi pada laju aliran yang meningkat, tidak seperti MSS dan MSPrismA. Peningkatan perpindahan massa dan kapasitas pengikatan yang lebih tinggi dari MSSpcc memungkinkan peningkatan produktivitas tanpa mengurangi CU secara signifikan. Gambar 3d menyoroti bahwa pada 5 g/L, MSSpcc mencapai CU yang lebih tinggi untuk produktivitas yang sama dibandingkan dengan resin lainnya. Untuk produktivitas di atas 70 mg/mL res/jam, MSSpcc mempertahankan nilai CU setidaknya 5% lebih tinggi daripada yang lain, menjadikannya pilihan terbaik pada konsentrasi umpan ini. Pengujian pada konsentrasi umpan 20 g/L mengungkapkan bahwa tidak ada solusi front Pareto yang layak. Konsentrasi tinggi memenuhi situs pengikatan dengan cepat, yang menyebabkan potensi terobosan produk dan kehilangan hasil. Fase pencucian yang saling berhubungan mungkin tidak mencukupi, memerlukan interupsi beban sampel, sehingga gagal mencapai sistem yang berkelanjutan. Kolom yang lebih besar mungkin membuat konsentrasi ini layak.
Pareto front menyediakan serangkaian solusi optimal untuk memaksimalkan produktivitas dan CU dalam 3C-PCC. Studi ini mengidentifikasi 150 solusi optimal, tetapi solusi terbaik bervariasi berdasarkan faktor-faktor seperti peralatan, personel, kapasitas hulu, dan ruang fasilitas. Meskipun “satu solusi optimal yang sebenarnya” tidak dapat ditemukan, produksi berkelanjutan menyediakan alternatif yang lebih baik untuk produksi mAb daripada produksi batch. Dari perspektif produksi, produksi berkelanjutan menghasilkan CU dan Produktivitas yang lebih tinggi daripada produksi batch, dan juga menguntungkan secara ekonomi, seperti yang ditunjukkan baru-baru ini untuk permintaan tahunan yang berkisar antara 100 kg hingga 1 ton. 35
3.3 Batch versus kontinyu
Perbandingan antara mode operasi batch dan kontinu penting untuk memahami apakah operasi kontinu memungkinkan tercapainya proses yang memiliki produktivitas dan CU lebih tinggi daripada batch. 17 Karena dalam 3C-PCC pemuatan saling berhubungan, diharapkan bahwa front Pareto untuk proses kontinu berada di atas front Pareto untuk proses batch. Faktanya, inilah yang diamati untuk semua resin (Gambar 3 ). Produktivitas yang lebih tinggi dicapai dengan memiliki laju aliran yang lebih tinggi dan, oleh karena itu, throughput material yang lebih tinggi. Peningkatan laju aliran akan menghasilkan waktu terobosan lebih awal dan BTC yang lebih dangkal, yang berarti bahwa menghubungkan kolom diperlukan untuk meningkatkan CU tanpa mengorbankan produktivitas dan hasil. Dengan menghubungkan kolom, pemuatan dapat dilakukan hingga %s yang lebih tinggi , yang berarti lebih banyak protein yang dimuat ke kolom dan akibatnya lebih banyak protein yang diserap ke tempat pengikatan yang tersedia, yang mengarah ke CU yang lebih tinggi. Karena optimasi dibatasi pada hasil 99%, proses batch akan memiliki CU yang lebih rendah, karena %s yang dicapai oleh proses ini akan jauh lebih rendah daripada yang dapat dicapai untuk proses berkelanjutan.
Perbandingan Pareto front untuk proses batch dan kontinyu telah ditunjukkan sebelumnya. 20 Dalam studi saat ini, perbandingan antara mode operasi batch dan kontinyu dilakukan untuk 5 g/L, karena fokusnya adalah mengoptimalkan titer saat ini dan mempersiapkan titer yang lebih tinggi di masa mendatang. Untuk semua resin, Pareto front batch mengikuti Pareto front kontinyu dengan cara yang tampak paralel. Dengan menghubungkan kolom-kolom, %s yang lebih tinggi di kolom pertama dapat dicapai, dan CU ditingkatkan untuk produktivitas yang sama. Misalnya, untuk produktivitas 70 mg/mL res/h, CU operasi kontinyu meningkat 27, 19, dan 13% dibandingkan dengan batch, untuk MSS, MSPrismA, dan MSSpcc, masing-masing. Untuk CU 80%, produktivitas 91, 67, dan 82% lebih tinggi dibandingkan dengan batch, untuk MSS, MSPrismA, dan MSSpcc, masing-masing. Ini menunjukkan potensi kromatografi kontinu, dengan peningkatan besar dalam produktivitas dan CU yang memungkinkan penggunaan mode operasi ini. Meskipun demikian, terlihat bahwa proses batch untuk konsentrasi umpan ini masih dapat mencapai produktivitas tinggi. Ini mengorbankan CU yang lebih rendah, yang disebabkan oleh waktu terobosan lebih awal untuk proses dengan laju aliran yang lebih tinggi. CU yang lebih rendah menyebabkan biaya produksi yang lebih tinggi, karena resin digunakan secara kurang efisien, dan lebih banyak volume buffer per gram produk diperlukan. Pada akhirnya, mode operasi kontinu dapat menawarkan KPI proses yang lebih baik dibandingkan dengan mode operasi batch. Namun, ini datang dengan kompleksitas operasional yang lebih tinggi, dan pilihan mode operasi batch atau kontinu tergantung pada skenario manufaktur dan tujuan pabrikan.
3.4 Pengujian berkelanjutan mAb murni—Protein A
Hasil optimasi memberikan beberapa wawasan tentang kinerja tiga resin yang berbeda. Namun, penting untuk memahami apakah hasil model sesuai dengan hasil eksperimen. Untuk melakukan ini, eksperimen 3C-PCC dilakukan dengan masing-masing resin yang berbeda, untuk konsentrasi umpan 5 g/L, dan KPI eksperimen dibandingkan dengan KPI model. Untuk membandingkan resin yang berbeda, produktivitas 100 mg/mL res/h dipilih untuk semua resin, dan laju aliran pemuatan yang sesuai dan %s (diambil dari simulasi front Pareto) digunakan untuk setiap eksperimen resin. Gambar 4 menunjukkan kromatogram yang dihasilkan dari perbandingan ini untuk MSPrismA. Sebanyak 8 siklus (memuat penuh ketiga kolom) dilakukan, di mana siklus pertama adalah fase permulaan dan siklus terakhir dianggap sebagai fase penghentian. Penyuntikan pertama dilakukan di C3, yang berarti bahwa penyuntikan di C1 dari siklus pertama adalah puncak kedua dalam kromatogram total.
GAMBAR 4
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Validasi eksperimental model kromatografi berkelanjutan untuk langkah penangkapan dengan sampel mAb murni menggunakan MSPrismA. Konsentrasi awal adalah 5 g/L dan laju alir pemuatan adalah 0,71 mL/menit. (a) Total kromatogram; (b) Perbesar keadaan stabil operasi siklik 3C-PCC; (c) Data model untuk periode siklik yang sama seperti yang ditunjukkan pada B. Pada (a) dan (b), hitam dan merah masing-masing mewakili konsentrasi yang diamati pada UV1 dan UV2. Pada (c), hitam, merah, dan biru masing-masing mewakili konsentrasi outlet yang diprediksi dari model untuk kolom 1, 2, dan 3.
Gambar 4a menunjukkan kromatogram total dari proses berkelanjutan. Konsentrasi diperkirakan dari sinyal UV dan kurva kalibrasi yang sesuai dalam sistem ÄKTA Avant, yang linier hingga 5 g/L. Konsentrasi maksimum puncak elusi jauh di atas 9 g/L, dan apa yang dapat dilihat pada gambar adalah artefak dari saturasi sinyal dalam detektor UV sistem ÄKTA. Gambar 4b menunjukkan bagian kondisi tunak dari operasi ini. Dapat dilihat bahwa dari siklus kedua, operasi sudah dalam kondisi tunak melalui kesamaan bentuk BTC dari siklus yang berbeda. Gambar 4c menunjukkan operasi kondisi tunak dari proses yang sama yang dilakukan secara silico , dengan kondisi operasi yang dipilih sama dengan yang digunakan dalam percobaan. Profil eksperimen dari proses 3C-PCC sangat mirip dengan profil model untuk semua tahap kromatografi yang berbeda, seperti profil pemuatan (bentuk kurva terobosan dalam siklus yang berbeda) dan profil pencucian dan elusi. Model tersebut bahkan menangkap “puncak” sangat kecil yang dapat dilihat pada awal pencucian, yang merupakan artefak karena penggunaan laju aliran yang lebih tinggi untuk tahap pencucian dibandingkan dengan tahap pemuatan (juga diamati dalam percobaan). Kurva pencucian model menunjukkan penurunan konsentrasi yang lebih tajam jika dibandingkan dengan kurva eksperimen, yang terutama dapat dikaitkan dengan kurangnya idealitas eksperimen dibandingkan dengan model. Model tersebut juga tidak menangkap puncak kecil CIP. Ini karena ketika memodelkan sistem, diasumsikan bahwa tidak ada mAb yang akan terikat secara ireversibel ke kolom; oleh karena itu, model tersebut memperkirakan bahwa semua mAb yang diserap dalam fase pemuatan akan dikumpulkan dalam eluat. Meskipun demikian, sudah diharapkan bahwa akan ada beberapa kehilangan produk dalam tahap CIP, yang diamati secara eksperimental.
Tabel 1 menunjukkan perbandingan antara KPI yang diprediksi oleh model dalam pengoptimalan dan apa yang diperoleh secara eksperimental, untuk target produktivitas 100 mg/mL res/jam, untuk tiga resin yang berbeda. Target produktivitas didasarkan pada pengoptimalan menggunakan konsentrasi umpan 5 g/L. Pada kenyataannya, larutan yang disiapkan untuk eksperimen 3C-PCC memiliki konsentrasi yang sedikit berbeda dari 5 g/L (MSS—4,92 g/L; MSPrismA—4,83 g/L; MSSpcc—4,9 g/L), dan nilai konsentrasi ini digunakan untuk memperkirakan KPI dari resin yang berbeda dan memberikan perbandingan yang adil. Hasil eksperimen untuk resin yang berbeda menunjukkan kesepakatan yang sangat baik antara KPI yang diprediksi oleh model dan KPI eksperimental. Nilai hasil eksperimental lebih rendah dari batasan hasil 99% model. Seperti disebutkan di atas, model mengasumsikan bahwa semua protein yang teradsorpsi akan diperoleh kembali dalam eluat, dengan kehilangan hasil terutama disebabkan oleh kehilangan dalam terobosan kolom kedua dalam fase yang saling berhubungan. Namun, dalam praktiknya, ini tidak terjadi, karena beberapa mAb mengikat lebih erat dan hanya dapat dipindahkan dengan kondisi kimia yang lebih keras, seperti tahap CIP, yang menjelaskan puncak kecil yang diamati dalam tahap CIP pada Gambar 4. Meskipun demikian, deviasi hasil antara hasil eksperimen dan simulasi untuk semua resin di bawah 4%.
TABEL 1. Perbandingan indikator kinerja utama (KPI) model dan eksperimen untuk eksperimen mAb murni, dengan 3 resin Protein A berbeda yang diuji.
Catatan : Konsentrasi umpan yang digunakan untuk nilai model sama dengan konsentrasi umpan untuk setiap percobaan: MSS—4,92 g/L; MSPrismA—4,83 g/L; MSSpcc—4,9 g/L. Laju aliran pemuatan untuk setiap resin: MSS—0,70 mL/menit; MSPrismA—0,71 mL/menit; MSSpcc—0,72 mL/menit.
Nilai produktivitas eksperimen juga sesuai dengan nilai eksperimen untuk 3 resin yang diteliti. Nilai produktivitas bergantung pada nilai hasil karena merupakan pengukuran output proses. Jika output lebih rendah karena hasil yang lebih rendah, produktivitas proses juga akan lebih rendah. Hal ini dikonfirmasi oleh deviasi produktivitas yang lebih besar yang berasal dari resin yang memiliki deviasi hasil yang lebih besar, yang untuk produktivitas tidak lebih besar dari 3,9% untuk semua resin.
CU adalah pengukuran jumlah mAb yang benar-benar diserap ke resin dalam satu siklus dibandingkan dengan jumlah total teoritis mAb yang dapat diserap resin (jika semua tempat pengikatan terisi). Secara keseluruhan, CU dari prediksi model dan nilai eksperimen saling sesuai, tetapi keduanya bervariasi antara resin yang berbeda, bertentangan dengan hasil dan produktivitas. Hal ini karena kendala hasil 99% dan produktivitas yang dipilih sebesar 100 mg/mL res /jam sebagai KPI untuk semua resin. Semua resin menunjukkan CU yang cukup tinggi (semuanya di atas 78%), dengan MSSpcc menunjukkan CU tertinggi pada 88%, yang sudah diharapkan dari hasil optimasi.
Nilai %s untuk MSPrismA dan MSSpcc mengikuti prediksi dari model. Namun, %s eksperimental untuk MSS lebih tinggi daripada yang diprediksi model. Perbedaan utama antara model dan eksperimen adalah bahwa model dibangun tanpa volume mati di antara kolom. Volume mati terbesar antara kedua kolom diperkirakan sebesar 75 μL, yang hanya 7,5% dari volume kolom. Selain volume rendah, larutan juga kurang terkonsentrasi daripada umpan langsung, karena itu adalah terobosan kolom pada posisi i , oleh karena itu mengapa itu dianggap tidak memiliki pengaruh. Karena MSS memiliki BTC paling curam dari tiga resin (Gambar SI 2 ), awalnya dihipotesiskan bahwa volume mati dapat menjadi faktor yang berkontribusi, tetapi volume kecil tidak membenarkan perbedaan ini. Dihipotesiskan bahwa kapasitas kolom MSS yang digunakan bisa sedikit lebih rendah daripada yang diperkirakan model. Kapasitas yang lebih rendah menyebabkan BTC bergeser pada sumbu-x ke kiri, dan dalam skenario ini, untuk volume injeksi yang sama, model dapat memprediksi %s lebih rendah dari kenyataan. Nilai kapasitas yang lebih rendah ini memengaruhi lebih banyak %s daripada KPI lainnya karena peningkatan %s pada nilai-nilai tersebut tidak terlalu memengaruhi total massa yang diserap dalam satu siklus. Secara total, jumlah mAb yang sama dilewatkan melalui kolom dalam model dan secara eksperimental, dengan dampak yang mungkin berupa kehilangan hasil dalam eksperimen dan nilai %s yang lebih tinggi diperkirakan.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa model mekanistik untuk kolom kromatografi 25 dan model kontinyu yang digunakan dalam konteks penelitian ini tervalidasi, baik oleh profil konsentrasi dari percobaan in-silico maupun lab maupun oleh KPI yang diperoleh. Model kontinyu yang disajikan dapat digunakan untuk mengoptimalkan pengoperasian kromatografi 3C-PCC dengan akurasi yang tinggi. Mengingat KPI dari berbagai resin, MSSpcc adalah resin yang dipilih untuk uji panen karena menunjukkan kinerja terbaik dari semua kandidat resin yang dievaluasi.
3.5 Panen terus-menerus—MSSpcc
Setelah melakukan percobaan 3C-PCC dengan mAb murni untuk kandidat resin yang berbeda, resin dengan kinerja terbaik (MSSpcc) dipilih untuk menangkap mAb dari larutan panen. Gambar 5 menunjukkan kromatogram hasil percobaan dengan larutan panen. Dalam kasus 3C-PCC untuk larutan panen, sinyal UV dasar jauh lebih tinggi daripada yang diamati untuk studi mAb murni, karena adanya komponen yang berbeda dalam larutan (HCP, materi genetik, dan lain-lain). Akibatnya, penerjemahan langsung dari sinyal UV ke konsentrasi mAb tidak memungkinkan untuk percobaan panen.
GAMBAR 5
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Percobaan tahap penangkapan dengan pemanenan. (a) Kromatogram panjang penuh; (b) Perbesar fase awal percobaan; (c) Perbesar bagian operasi siklik kromatografi kontinyu. Dalam semua grafik, hitam dan merah menunjukkan nilai absorbansi pada 280 nm dalam UV1 dan UV2, masing-masing.
Gambar 5b menunjukkan fase permulaan, dan Gambar 5c menunjukkan fase kondisi mapan dari operasi 3C-PCC. Dari Gambar 5b , dapat dilihat bahwa sinyal UV dasar berada di sekitar 1800 mA.U., dan dari Gambar 5b,c , dapat dilihat BTC dari pemuatan kolom, bahkan dengan nilai dasar yang tinggi. Nilai dasar yang tinggi membuat %s tidak dapat dihitung karena KPI ini diestimasi berdasarkan kromatogram, dan pengambilan sampel hanya dilakukan selama langkah elusi. Perbedaan lain dari percobaan mAb murni adalah adanya puncak pada UV2 selama fase pencucian, yang berhubungan dengan komponen dalam larutan yang dicuci dan tidak teradsorpsi ke kolom yang menerima pencucian dari kolom yang dicuci. Pada Gambar 5c , dapat dilihat bahwa operasi mencapai kondisi mapan dan sinyal UV selama pemuatan, pencucian, elusi, dan CIP konsisten dari waktu ke waktu.
Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa perilaku adsorpsi mAb yang dipelajari tidak berubah secara signifikan antara larutan mAb murni atau mAb dalam panen. 25 Berdasarkan pengamatan ini, diharapkan bahwa KPI MSSpcc menggunakan panen akan sebanding dengan hasil dari percobaan mAb murni. Untuk menilai apakah KPI larutan panen sebanding dengan larutan murni dan optimasi in-silico , KPI dihitung dan ditunjukkan dalam Tabel 2. KPI model yang ditunjukkan dalam Tabel 2 untuk MSSpcc adalah hasil yang diperoleh dari optimasi pada konsentrasi umpan 5 g/L, oleh karena itu mengapa ini berbeda dari apa yang ditunjukkan dalam Tabel 1 (yang diperoleh dengan menggunakan konsentrasi sampel sebenarnya untuk uji coba mAb murni MSSpcc). Konsentrasi umpan 5 g/L mAb untuk uji coba panen disiapkan seperti yang dijelaskan dalam Bagian 2.3 . Hasil dalam Tabel 2 menunjukkan sedikit penurunan dalam hasil dan produktivitas dan penurunan yang lebih nyata dalam CU, dibandingkan dengan percobaan mAb murni. Mayoritas mAb teradsorpsi ke ligan protein A melalui daerah Fc. 36 Komponen panen dan pengotor lainnya (misalnya, metabolit, antibusa, dll.) dapat menyebabkan halangan sterik atau memiliki ikatan kompetitif, dan dengan demikian mengganggu adsorpsi mAb ke ligan ProA secara negatif, yang menjelaskan pengurangan yang diamati dalam CU. Meskipun demikian, proses tersebut menunjukkan bahwa ia dapat bekerja sangat mirip dengan proses mAb murni, dan nilai KPI yang diperoleh sangat dekat dengan apa yang diprediksi oleh optimasi. Selain KPI, kandungan monomer dan spesies Berat Molekul Tinggi dan Rendah (HMW dan LMW, masing-masing) ditentukan (Tabel 2 ). Dari hasil ini, kita dapat melihat bahwa langkah penangkapan berkelanjutan mampu memurnikan sampel awal hingga tingkat yang besar, dengan kandungan mAb (spesies monomer plus HMW) mewakili lebih dari 98,5% dari campuran akhir.
TABEL 2. Perbandingan model dan indikator kinerja utama (KPI) eksperimental untuk eksperimen panen, untuk MSSpcc dan CaptoS Impact.
Catatan : Persentase rata-rata spesies Monomer, HMW, dan LMW dalam fraksi eluat juga ditunjukkan, dengan kesalahan yang mewakili deviasi standar nilai eluat. Laju aliran pemuatan untuk setiap resin: MSSpcc—0,72 mL/menit; CaptoS Impact—0,36 mL/menit.
3.6 Optimasi PCC—CEX
Mirip dengan apa yang dilakukan untuk optimasi ProA, optimasi untuk langkah CEX dicapai dengan memperkirakan front Pareto untuk Produktivitas dan CU. Sekali lagi, Yield digunakan sebagai kendala. Secara total, dua resin berbeda digunakan untuk optimasi, dan optimasi dilakukan hanya untuk kasus proses berkelanjutan (3C-PCC). Optimasi ini difokuskan pada fase pemuatan untuk memaksimalkan indikator kinerja yang disebutkan di atas. Karena CEX adalah langkah pemolesan, ia digunakan untuk memoles larutan lebih lanjut dan menghilangkan HCP, ProA yang terlindi, agregat, dan spesies asam. Bergantung pada kandungan campuran setelah kromatografi ProA, seseorang mungkin ingin memilih indikator kinerja lain untuk optimasi (misalnya, kemurnian), yang dapat berarti mengoptimalkan fase pemuatan dan elusi secara bersamaan, di mana panjang gradien garam dapat terbukti menjadi kendala penting dalam skenario optimasi baru ini. Karena campuran yang diperoleh setelah percobaan batch sudah menunjukkan kemurnian yang sangat tinggi (96,6%, ditentukan menggunakan metodologi yang dijelaskan dalam Bagian 2.4 ), maka diputuskan untuk mempertahankan cakupan optimasi seperti yang dijelaskan dalam karya ini.
3.7 Pengaruh konsentrasi antibodi
Sebanyak empat konsentrasi berbeda diuji dalam pengoptimalan 3C-PCC untuk langkah CEX: 5, 10, 15, dan 20 g/L. Karena langkah penangkapan merupakan langkah pemurnian dan konsentrasi, konsentrasi umpan mAb yang lebih tinggi diuji untuk langkah CEX dibandingkan dengan langkah penangkapan. Konsentrasi mAb dalam eluat ProA lebih tinggi daripada umpan, bahkan dengan mempertimbangkan koreksi pH setelah VI. Hasil pengoptimalan untuk SP Seph FF dan CaptoS Imp ditunjukkan pada Gambar 6 .
GAMBAR 6
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Bagian depan Pareto dari dua resin CEX yang berbeda dipelajari untuk langkah pemolesan mAb. Merah dan hijau masing-masing mewakili CaptoS ImpAct dan SP Seph FF. Optimasi dilakukan untuk mode kontinu pada konsentrasi umpan 5, 10, 15, dan 20 g/L.
Dengan membandingkan bagian depan Pareto untuk kedua resin, dapat dilihat bahwa CaptoS Imp menunjukkan bagian depan Pareto yang lebih baik, karena untuk konsentrasi yang sama, produktivitas secara umum jauh lebih tinggi pada CU yang sama. Kurva CaptoS Imp untuk 5 dan 10 g/L praktis tumpang tindih dengan kurva SP Seph FF untuk 10 dan 20 g/L, yang menyoroti kinerja CaptoS Imp yang lebih unggul. Seperti yang disebutkan untuk resin ProA, profil BTC sangat memengaruhi bagian depan Pareto, terkadang jauh lebih signifikan daripada kapasitas pengikatan. Dari 2 resin yang dipelajari, SP Seph FF memiliki kapasitas pengikatan yang lebih tinggi dibandingkan dengan CaptoS Imp ( res 97 mg/mL vs. res 82 mg/mL ), 25 tetapi BTC-nya lebih datar. Oleh karena itu, pada laju alir yang sama diharapkan bahwa profil BTC CaptoS Imp yang lebih tajam akan menguntungkan dalam fase pemuatan yang saling berhubungan, mencegah kerugian pada kolom kedua. Hal ini sejalan dengan apa yang diiklankan oleh Cytiva karena CaptoS Imp dirancang sebagai resin resolusi tinggi.
Bagian depan Pareto untuk kedua resin pada Gambar 6 juga menunjukkan bahwa konsentrasi umpan yang lebih tinggi akan menghasilkan kurva Pareto yang lebih datar. Hal ini diharapkan karena untuk mencapai produktivitas yang sama, laju alir yang lebih rendah dapat digunakan untuk memperoleh profil BTC yang lebih tajam, sehingga meningkatkan CU. 20 Produktivitas maksimum yang lebih rendah yang dicapai untuk CaptoS Imp untuk 20 g/L dibandingkan dengan 15 g/L dibenarkan oleh kendala hasil. Untuk meningkatkan produktivitas, perlu untuk meningkatkan laju alir dan, pada 20 g/L, peningkatan yang diperlukan untuk mencapai produktivitas yang lebih tinggi juga akan menghasilkan BTC yang lebih dangkal, yang menyebabkan terobosan awal di kolom kedua. Oleh karena itu, ada batas produktivitas yang terkait dengan setiap konsentrasi umpan, yang untuk larutan 20 g/L dan kondisi operasi yang diuji adalah sekitar 200 mg/mL res/jam. Kondisi operasi (laju alir, volume kolom, dll.) juga memengaruhi nilai produktivitas maksimum yang dapat dicapai untuk setiap konsentrasi umpan.
3.8 CEX Kontinyu dengan eluat panen kontinyu
Proses CEX 3C-PCC dilakukan untuk meniru apa yang dapat diimplementasikan dalam proses end-to-end yang berkelanjutan. Untuk tujuan ini, eluat dari proses panen ProA dikumpulkan dan dicampur, dan setelah VI (dicapai dengan penahanan pH rendah selama minimal 1 jam), pH dikoreksi menjadi 4,5. Konsentrasi kumpulan ini adalah 12 g/L, yang diencerkan menjadi 10 g/L agar sebanding dengan pengoptimalan yang ditunjukkan pada Gambar 6. CaptoS Imp menunjukkan KPI terbaik dari pengoptimalan in-silico ; oleh karena itu, resin ini dipilih sebagai resin CEX untuk langkah ini.
Saat mengoptimalkan proses secara berurutan, akan lebih baik jika melakukannya dengan cara mencocokkan hasil produksi produk pada setiap langkah daripada laju alir (asalkan VI dicapai dengan penahanan pH rendah dalam bejana lonjakan). Ini pada gilirannya berarti bahwa volume resin yang digunakan dalam langkah pemolesan bisa lebih rendah daripada yang digunakan dalam langkah penangkapan, menambahkan lapisan pengoptimalan lain dari proses global, dengan volume resin juga mungkin menjadi variabel desain. Karena resin CEX biasanya memiliki nilai DBC yang lebih tinggi daripada resin ProA, volume resin yang lebih rendah dengan produktivitas yang lebih tinggi dapat memiliki hasil produksi produk yang sama dengan langkah penangkapan, yang memfasilitasi hubungan antara kedua proses. Untuk pekerjaan saat ini, pengoptimalan dibatasi pada volume terkecil kolom pra-kemasan yang tersedia di pasaran (1 mL). Meskipun demikian, tujuan untuk mencocokkan produktivitas langkah penangkapan dan CEX masih tercapai, dan kondisi operasi yang terkait dengan proses dengan produktivitas 100 mg/mL res/jam digunakan untuk percobaan.
Kromatogram yang dihasilkan mirip dengan apa yang dapat diamati pada Gambar 4 , tetapi dengan konsentrasi yang berbeda yang dicapai (Gambar SI 6 ). Ini diharapkan karena sampel yang diperoleh setelah langkah ProA sudah sangat murni. KPI yang dihasilkan dari CEX 3C-PCC dirangkum dalam Tabel 2. Mirip dengan proses panen, %s tidak dapat ditentukan untuk CEX 3C-PCC karena sinyal UV berada di luar kurva kalibrasi dan tidak ada pengumpulan selama langkah pemuatan. Ini dapat diatasi dengan pengukuran offline aliran kolom i ke kolom i + 1 (yang tidak mungkin dalam konfigurasi yang disajikan) atau dengan menggabungkan alat PAT online yang dapat menentukan konsentrasi larutan protein pekat secara akurat. Nilai hasil yang sangat tinggi sesuai dengan apa yang diamati selama proses, dengan hampir tidak ada terobosan pada kolom kedua yang diamati selama pemuatan yang saling berhubungan atau puncak yang diamati dalam CIP. Baik CU eksperimental dan produktivitas sesuai dengan hasil optimasi, sekali lagi menyoroti kegunaan dan kemampuan prediktif dari model yang digunakan. Persentase monomer meningkat sedikit dengan langkah CEX. Kandungan LMW menurun dan untuk HMW, kandungannya meningkat. Karena kandungan spesies bersifat relatif, pengurangan jumlah spesies LMW akan menyebabkan peningkatan kandungan monomer dan HMW, bahkan dengan mempertimbangkan bahwa jumlah keduanya tetap sama setelah percobaan CEX. CEX digunakan sebagai langkah pemolesan untuk memisahkan monomer dari pengotor yang tersisa, yang dapat berupa agregat, ProA yang terlindi, protein asam, dan materi genetik, antara lain. Parameter operasi untuk menghilangkan beberapa pengotor ini (terutama pengotor terkait produk) mungkin memerlukan operasi pada kondisi sub-optimal untuk produktivitas dan/atau CU. ProA rekombinan memiliki pI lebih rendah daripada mAb (4,7–4,8) 37 dan itu sangat dekat dengan pH operasi untuk proses CEX, yang menjadikan CEX sebagai langkah yang sesuai untuk menghilangkan ProA yang terlindi. Karena ProA memiliki Mw rendah (45 kDa), pengurangan spesies LMW bisa jadi merupakan konsekuensi dari penghilangan ProA yang terlindi dari campuran.
3.9 Evaluasi model
Model berkelanjutan yang digunakan dalam penelitian ini digunakan untuk optimasi in-silico dari langkah ProA dan CEX 3C-PCC. Model divalidasi secara eksperimental untuk langkah ProA menggunakan larutan mAb murni untuk tiga resin ProA yang dipilih, dengan semua resin menunjukkan KPI eksperimental sesuai dengan prediksi model. Eksperimen 3C-PCC dengan resin ProA berkinerja terbaik digunakan untuk memurnikan mAb dari campuran panen, menghasilkan hasil yang sebanding dengan eksperimen mAb murni dan prediksi model. Eluat dari 3C-PCC dengan larutan panen digunakan sebagai umpan untuk CEX 3C-PCC, yang berfungsi sebagai validasi eksperimental optimasi CEX. KPI eksperimental yang diperoleh juga sesuai dengan prediksi model.
Model kontinu mampu secara akurat memprediksi perilaku kromatografi untuk proses 3C-PCC. Seperti dapat dilihat pada Gambar 4 (dan Gambar SI 3 dan 4 ), prediksi model kromatogram dan kromatogram eksperimen memiliki profil yang sangat mirip. Model tersebut juga memprediksi bahwa proses akan mencapai kondisi tunak dari siklus kedua dan seterusnya (data tidak ditampilkan), yang sesuai dengan apa yang diamati secara eksperimen (Gambar 4a,b ). Model tersebut juga digunakan untuk mengoptimalkan langkah 3C-PCC, dan variabel operasi (laju aliran dan %s ) yang sesuai dengan produktivitas 100 mg/mL res/jam dipilih untuk validasi eksperimen, baik untuk langkah ProA maupun CEX. Hasil penelitian menunjukkan bahwa model tersebut dapat secara akurat memprediksi KPI untuk ProA (dengan mAb murni dan panen) dan CEX 3C-PCC, dengan deviasi lebih rendah dari 6,8%, dalam kasus terburuk. Oleh karena itu, model yang disajikan menyediakan alat yang ampuh untuk pengoptimalan proses yang cepat dan akurat.
4 KESIMPULAN
Pekerjaan ini difokuskan pada optimasi in-silico dari langkah kromatografi berkelanjutan untuk penangkapan dan pemolesan antibodi monoklonal. Pendekatan ini difokuskan pada penggunaan model mekanistik untuk simulasi perilaku kromatografi dan menggunakan dua KPI yang berbeda sebagai tujuan optimasi: Produktivitas dan Pemanfaatan Kapasitas. Karena produktivitas tidak dapat dioptimalkan tanpa menghukum CU, dan sebaliknya, front Pareto dibuat dan digunakan untuk mengidentifikasi kondisi operasi terbaik menurut KPI yang diinginkan untuk setiap proses.
Mengingat kemajuan terkini dalam USP, konsentrasi umpan mAb yang tinggi digunakan untuk pengoptimalan langkah penangkapan 3C-PCC (2, 5, 7,5, dan 10 g/L). Hasil model divalidasi secara eksperimental untuk semua resin ProA dengan larutan mAb murni pada 5 g/L, dengan variabel operasi dipilih untuk produktivitas sekitar 100 mg/mL res/jam untuk semua resin. KPI dari panen berjalan serupa dengan prediksi model; dengan demikian, hasil pengoptimalan untuk kromatografi ProA dengan mAb murni dapat digunakan untuk mengoptimalkan kromatografi ProA menggunakan panen.
CEX 3C-PCC juga dioptimalkan untuk dua resin berbeda (SP Seph FF dan CaptoS Imp) dan empat konsentrasi berbeda (5, 10, 15, dan 20 g/L). SP Seph FF memiliki kapasitas pengikatan yang lebih tinggi daripada CaptoS Imp tetapi BTC yang kurang tajam; oleh karena itu, front Pareto dari CaptoS Imp menunjukkan bahwa kinerjanya akan lebih baik daripada SP Seph FF. Validasi eksperimental pada produktivitas 100 mg/mL res/jam menunjukkan kesesuaian antara hasil eksperimen dan model. Oleh karena itu, kita dapat menyimpulkan bahwa BTC yang tajam lebih unggul daripada kapasitas pengikatan untuk proses berkelanjutan, yang biasanya bukan merupakan parameter yang dipertimbangkan untuk pemrosesan batch.
Meskipun langkah ProA dan CEX tidak saling berhubungan dalam model, model tersebut masih dapat digunakan untuk merancang proses di mana ProA dan CEX saling berhubungan, dengan langkah VI di antaranya. Throughput dari proses (ProA, VI, dan CEX) dapat digunakan sebagai variabel keputusan untuk interkoneksi langkah-langkah tersebut, alih-alih laju aliran, yang biasanya digunakan. Jika VI dilakukan dalam setidaknya dua bejana lonjakan yang berbeda, kontinuitas umpan CEX 3C-PCC dapat dipastikan dan keluaran material secara berkala dapat dicapai. Pekerjaan eksperimental yang dijelaskan dapat digunakan untuk meniru langkah penangkapan dan pemolesan untuk pemurnian antibodi monoklonal dari larutan panen.
Sebagai kesimpulan, model yang disajikan mampu memprediksi perilaku kromatografi berkelanjutan untuk langkah penangkapan dan pemolesan dari proses mAb. Model tersebut divalidasi secara eksperimental untuk tiga resin ProA yang berbeda menggunakan sampel murni, dan resin dengan kinerja terbaik digunakan untuk pemurnian mAb dari larutan panen. Terakhir, optimasi CEX juga divalidasi secara eksperimental, menggunakan mAb yang dikumpulkan dari proses panen setelah pemurnian ProA sebagai umpan (pada konsentrasi umpan CEX 10 g/L). Produk akhir yang diperoleh di bawah kondisi proses yang dioptimalkan, pada konsentrasi umpan awal 5 g/L, berada dalam bentuk yang sangat murni (97,4% monomer, 1,5% HMW, 1,1% LMW) dan throughput prosesnya sekitar 100 mg/mL res /jam. Memperluas model saat ini dengan memasukkan parameter penuaan akan memberikan pemahaman yang lebih baik tentang kebutuhan penggantian kolom dan lebih mengoptimalkan pemanfaatan resin dengan meningkatkan jumlah siklus yang dilakukan. 38 Hal ini dapat membantu mengurangi COG lebih lanjut dengan memaksimalkan resin yang tersedia. Model mekanistik harus cukup akurat untuk menyediakan desain proses yang sesuai, dan peralihan ke ruang eksperimen akan mendapat manfaat dari adanya mekanisme kontrol, di mana langkah selanjutnya adalah menyempurnakan variabel operasi selama pemrosesan. 39 Hal ini memerlukan strategi PAT dan kontrol yang tepat dan dapat membantu mengurangi efek pengotoran dan kehilangan kapasitas sambil mempertahankan persyaratan kemurnian.
