Abstrak
Cyanobacteria adalah bakteri fotosintetik yang produktif dengan kemampuan adaptasi yang luar biasa, ditambah dengan fleksibilitas metabolisme yang tinggi, memungkinkan mereka untuk berkembang biak di berbagai habitat di seluruh dunia. Mereka memainkan peran kunci dalam produksi primer global dan siklus nutrisi, tetapi proliferasi spesies tertentu yang tidak terkendali dapat membahayakan kehidupan akuatik. Mekar cyanobacterial (cyanoblooms), yang dipicu oleh faktor-faktor seperti masuknya nutrisi, suhu, dan cahaya, berdampak signifikan pada dinamika ekosistem dan semakin intensif karena pemanasan global. Saat ini, tidak ada cara yang efisien untuk mengurangi dampak ini. Di sini, kami menunjukkan bahwa meta -tirosin ( m -Tyr), analog asam amino nonproteinogenik dari asam amino aromatik (misalnya, Phe dan Tyr), sangat beracun bagi berbagai cyanobacteria, sedangkan bakteri non-fotosintetik tampaknya jauh lebih rentan terhadap m -Tyr. Pemeriksaan dasar molekuler toksisitas m -Tyr dalam organisme model Synechocystis sp. PCC6803 bersifat kompleks. Analisis molekular dan biokimia menunjukkan perubahan homeostasis asam amino pada sianobakteri yang diberi m -Tyr. Studi proteomik selanjutnya menunjukkan bahwa m -Tyr salah dimasukkan oleh fenilalanil-tRNA sintetase (PheRS) ke dalam proteom Synechocystis , khususnya yang memengaruhi protein ribosomal serta protein terkait fotosintesis. Demikian pula, Synechocystis yang diberi m -Tyr menunjukkan perubahan aktivitas translasi dan fotosintesis, yang berkorelasi erat dengan retardasi pertumbuhan dan perubahan morfologi pada konsentrasi m -Tyr mikromolar, dan peningkatan mortalitas pada konsentrasi yang lebih tinggi. Temuan ini menunjukkan bahwa toksisitas m -Tyr terhadap Synechocystis merupakan hasil dari kombinasi efek seluler, termasuk perubahan metabolisme dan penggabungannya ke dalam proteom sianobakteri. Pemahaman ini mungkin juga berkontribusi pada pengembangan senyawa alami baru untuk mengendalikan sianobakteri yang berbahaya.
Singkatan
Ala
alanin
Argumen
arginin
Asn
asparagin
Asp
asam aspartat
B. subtilis
Bakteri subtilis
bunga sianobo
mekarnya sianobakteri
Cys
sisteina
Bakteri E.coli
Bakteri Escherichia coli
Gln
glutamin
lem
asam glutamat
Gliserin
glisin
HCD
disosiasi tumbukan berenergi tinggi
Miliknya
histidin
Pulau
isoleusin
Singa
leusin
Bohong
lisin
Bertemu
metionina
m -Tir
meta -tirosin
Phe
fenilalanin
Bahasa Inggris
fenilalanil-tRNA sintetase
Pro
prolin
SD
simpangan baku
Ser
serin
SpesifikasiR
gen resistan spektinomisin
Tiga
treonin
Trp
triptofan
Tiruan
tirosin
nilai
valin
Perkenalan
Cyanobacteria adalah organisme fotosintetik yang termasuk organisme tertua yang diketahui di Bumi, dengan beberapa fosil yang berpotensi berasal dari sekitar 3,5 miliar tahun yang lalu [ [ 1 ] ]. Kemampuan mereka untuk menghasilkan oksigen melalui fotosintesis memainkan peran penting dalam oksigenasi atmosfer Bumi, membuka jalan bagi evolusi bentuk kehidupan aerobik. Meskipun memiliki struktur seluler yang lebih sederhana daripada yang terlihat pada alga tunggal atau multiseluler dan tumbuhan darat [ [ 2 ] ], cyanobacteria dapat melakukan fotosintesis, menggunakan klorofil dan pigmen lain untuk menangkap energi cahaya dan mengubah CO 2 dan air menjadi senyawa organik (yaitu, gula), melepaskan oksigen sebagai produk sampingan [ [ 3 ] ]. Cyanobacteria juga menunjukkan berbagai morfologi, termasuk bentuk uniseluler, filamen, dan kolonial, dan dapat ditemukan di berbagai habitat, seperti air tawar, lingkungan laut, tanah terestrial, dan bahkan lingkungan ekstrem seperti sumber air panas dan daerah kutub [ [ 4 ] ]. Oleh karena itu, mereka memiliki adaptasi yang memungkinkan mereka untuk tumbuh subur dalam berbagai kondisi lingkungan, dari yang kaya nutrisi hingga yang miskin nutrisi, dan dari lingkungan dengan cahaya tinggi hingga yang kurang cahaya. Dalam kondisi lingkungan tertentu (misalnya, pengayaan nutrisi, suhu, dan cahaya), yang menghasilkan kondisi optimal untuk pertumbuhan, sianobakteri dapat mengalami pertumbuhan yang cepat, membentuk populasi padat yang dikenal sebagai bloom. ‘Cyanobloom’ seperti itu dapat memiliki efek merugikan pada ekosistem perairan dan menghasilkan racun berbahaya, menjadikannya masalah ekologi yang mendesak di seluruh dunia [ [ 5 – 7 ] ].
Di antara dampak paling langsung dari cyanobloom adalah penipisan kadar oksigen terlarut melalui proses-proses seperti respirasi dan dekomposisi bahan organik. Selain itu, cyanobacteria tertentu menghasilkan berbagai racun (misalnya, mikrokistin, saksitoksin, atau silinderospermopsin), yang menimbulkan ancaman bagi kesehatan manusia dan hewan [ [ 5 – 7 ] ]. Di lingkungan perairan, cyanobloom telah terlibat dalam kematian massal ikan, kerang, dan fauna perairan lainnya, serta penurunan keanekaragaman hayati dan ketahanan ekosistem. Mengatasi tantangan kompleks yang ditimbulkan oleh cyanobloom memerlukan pendekatan interdisipliner yang mengintegrasikan ekologi, limnologi, mikrobiologi, dan manajemen lingkungan. Dengan menjelaskan mekanisme yang mendorong pembentukan mekar dan memahami dampak ekologisnya, kita dapat mengembangkan strategi yang efektif untuk mengurangi konsekuensi negatif dari mekarnya cyanobacterial dan meningkatkan kesehatan dan keberlanjutan ekosistem perairan untuk generasi mendatang. Dampak-dampak ini menyebabkan dikembangkannya berbagai metode untuk mengatasi cyanobacteria dan racun-racun yang terkait dengannya [ [ 8 – 10 ] ], namun pendekatan-pendekatan tersebut belum cukup aktif, aman, atau hemat biaya.
Asam amino nonprotein m- Tyr adalah analog fenilalanin (Phe), yang diketahui diproduksi secara alami melalui oksidasi Phe [ [ 11 – 13 ] ] (Gbr. 1A ). Berbagai data menunjukkan bahwa m -Tyr mungkin memiliki efek berbahaya pada berbagai sistem biologis, termasuk bakteri, sel tumbuhan, dan hewan [ [ 14 – 16 ] ]. Namun, tampaknya ada perbedaan sensitivitas antar spesies, dengan tumbuhan terbukti lebih rentan terhadap toksisitas m- Tyr daripada organisme lain [ [ 11 , 17 ] ]. Beberapa tumbuhan darat, seperti Euphorbia myrsinites atau Festuca rubra , dapat menghasilkan m- Tyr tingkat tinggi di jaringan akarnya dan mengeluarkannya untuk menghambat kehidupan tumbuhan di dekatnya [ [ 12 – 14 ] ]. Selain pada tanaman, m -Tyr juga dapat diproduksi secara enzimatik oleh fenilalanin meta-hidroksilase pada bakteri Streptomyces coeruleorubidus dan mungkin juga pada bakteri lain yang mungkin mengandung enzim ini [ [ 18 ] ].
Gbr. 1
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Efek m- Tyr pada pertumbuhan bakteri. (A) Struktur molekul aromatik yang dibahas dalam penelitian ini: (1) Fenilalanina (Phe); (2) Tirosin (Tyr), diproduksi dari Prephenate melalui jalur shikimate, atau dikatalisis dari Phe oleh enzim fenilalanina hidroksilase pada mamalia; (3) m -tirosin ( m -Tyr) yang dapat diproduksi secara enzimatik pada beberapa spesies tanaman atau oleh hidroksilasi radikal bebas dalam kondisi stres oksidatif. (B) Laju pertumbuhan B. subtilis (panel kiri) dan E. coli (panel kanan) dengan atau tanpa adanya berbagai konsentrasi m -tirosin, seperti yang ditunjukkan dalam histogram. (C) Laju pertumbuhan Synechocystis sp. PCC6803 (panel kiri) dan M. aeruginosa (panel kanan) tumbuh dalam medium YBG11 dengan atau tanpa adanya berbagai konsentrasi m -tirosin, seperti yang ditunjukkan dalam histogram, setelah 5 hari dengan atau tanpa adanya berbagai konsentrasi m -tirosin. Data ditentukan dengan mengukur kepadatan sel pada OD = 600 nm (untuk E. coli dan B. subtilis ) dan OD = 730 nm (untuk Synechocystis dan M. aeruginosa ). Panel bawah menunjukkan kultur cair representatif dari sianobakteri yang tumbuh pada berbagai konsentrasi m -tirosin. (D) Uji mortalitas dilakukan pada kultur Synechocystis berumur 5 hari , yang tumbuh dengan atau tanpa adanya berbagai konsentrasi m- Ty. Setelah 5 hari perawatan, kultur dibawa ke kepadatan sel yang sama (yaitu, OD 730 = 0,5), dan 2,0 μL dari setiap sampel ditaburkan pada pelat BGII tanpa m- Tyrus. Mikrograf menunjukkan sel-sel setelah 7 hari. Batang mewakili 1,0 cm. Nilai-nilai tersebut merupakan rata-rata dari tiga (data laju pertumbuhan untuk E. coli , B. subtilis , dan M. aeruginosa ) dan tujuh (data laju pertumbuhan untuk Synechocystis ) replikasi biologis. Batang galat menunjukkan deviasi standar (SD).
Dasar molekuler dari toksisitas m-Tyr masih menunggu karakterisasi lebih lanjut. Hal ini mungkin berhubungan dengan metabolisme sel yang berubah, atau kesalahan penggabungan asam amino teroksidasi alih-alih asam amino alami ke dalam proteom sel. Memang, m- Tyr terbukti dimasukkan ke dalam sel hewan secara in vitro [ [ 19 ] ]. Sebelumnya, kami menunjukkan bahwa toksisitas m- Tyr pada tanaman dikaitkan dengan perubahan biosintesis asam amino dan penggabungannya ke dalam protein mitokondria dan plastidial sebagai pengganti Phe [ [ 12 ] ], suatu aktivitas yang kemungkinan dimediasi oleh organel fenilalanil-tRNA sintetase (PheRS) yang ditargetkan secara ganda [ [ 20 , 21 ] ]. Dalam penelitian ini, kami menunjukkan bahwa Synechocystis sp. PCC 6803 (selanjutnya disebut Synechocystis ) dan spesies sianobakteri lainnya secara signifikan lebih sensitif terhadap toksisitas m -Tyr daripada bakteri non-fotosintetik. Studi proteomik dan metabolomik menunjukkan bahwa m -Tyr memengaruhi metabolisme asam amino dan dapat salah dimasukkan ke dalam proteom sianobakteri, khususnya berdampak pada protein terkait fotosintesis. Dengan demikian, sel Synechocystis yang tumbuh dengan adanya konsentrasi rendah (mikromolar) m -Tyr menunjukkan ekspresi gen yang berkurang dan aktivitas fotosintesis yang berubah, yang terkait erat dengan morfologi sel yang abnormal, fisiologi yang berubah, dan akhirnya, kematian sel pada kadar m -Tyr yang lebih tinggi. Efek dari m -Tyr tidak berkurang ketika sel tumbuh secara kemoheterotrofik (yaitu, dalam kondisi cahaya rendah untuk mempertahankan pertumbuhan yang bergantung pada glukosa dalam kegelapan) [ [ 22 ] ], menunjukkan bahwa fenotipe ini sangat terkait dengan (salah)penggabungannya ke dalam proteom cyanobacterial dan perubahan aktivitas seluler global.
Hasil
Efek toksisitas m -Tyr pada cyanobacteria
Bakteri, fungi, dan hewan tampak lebih tahan terhadap pengobatan m- Tyr daripada tanaman darat [ [ 11 , 12 , 14 ] ]. Pengobatan kultur Bacillus subtilis dan Escherichia coli dengan m- Tyr, dalam konsentrasi hingga 1,5 mm , tidak memiliki efek signifikan pada sel bakteri, seperti yang ditunjukkan oleh laju pertumbuhannya tanpa atau dengan adanya analog asam amino (Gbr. 1B ). Secara luas diterima bahwa kloroplas dalam alga dan tanaman berasal dari hubungan endosimbiosis dengan sel sianobakteri leluhur. Sebelumnya, kami menunjukkan bahwa dalam Arabidopsis, m- Tyr dapat salah terintegrasi ke dalam proteom organel, yang mengakibatkan perubahan morfologi organel dan berkurangnya aktivitas fotosintesis [ [ 12 ] ]. Oleh karena itu, menarik untuk menganalisis efek m- Tyr pada sel sianobakteri yang hidup bebas. Untuk tujuan ini, Synechocystis sp. PCC6803 dikulturkan dalam media YBGII yang dilengkapi dengan berbagai konsentrasi m- Tyr. Pertumbuhan dan kelangsungan hidup Synechocystis ditemukan sangat terpengaruh oleh penambahan analog nonproteinogenik ke dalam media pertumbuhan, pada konsentrasi dalam kisaran mikromolar rendah (Gbr. 1C ). Pada 4 μ m – Tyr, pertumbuhan Synechocystis sangat terhambat, sedangkan kepadatan kultur tetap rendah secara konstan pada konsentrasi m- Tyr yang lebih tinggi dari 8 μ m (Gbr. 1C ), yang menunjukkan terhentinya pertumbuhan sel dalam kondisi ini.
Pertumbuhan yang berkurang yang kami amati menyiratkan pembelahan sel yang terhenti atau kematian sel. Untuk mengatasi hal ini, sel-sel dari kultur sianobakteri yang diberi dan tidak diberi perlakuan berumur 5 hari dipanen (yaitu, dipeletkan dengan sentrifugasi) dan disuspensikan kembali dalam medium baru (yang telah dikurangi m- Tyr) hingga konsentrasi ~ 0,5 OD730 nm·mL −1 . Untuk setiap analisis, 2 μL kultur ditanam pada media agar BG11, dan sel-sel ditumbuhkan selama 1 minggu pada suhu 30 °C di bawah cahaya konstan. Percobaan menunjukkan bahwa kepadatan sel yang berkurang berkorelasi dengan peningkatan kadar m -Tyr (yaitu, kepadatan sel sekitar 20% lebih rendah dalam kultur yang diberi perlakuan dengan 6 μ m , dan sekitar 80% pengurangan kepadatan sel dengan adanya 12,5 μ m m-Tyr) (Gbr. 1D ). Data ini menunjukkan bahwa pada konsentrasi ≥ 6 μm , m – Tyr kemungkinan menyebabkan kematian sel. Kami selanjutnya menganalisis apakah efek m- Tyr spesifik terhadap Synechocystis atau mungkin juga memengaruhi spesies sianobakteri lainnya. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1C , efek serupa diamati pada galur penghasil toksin Microcystis aeruginosa , yang menunjukkan bahwa m -Tyr bersifat toksik terhadap berbagai spesies sianobakteri.
Kinerja fotosintesis dan biogenesis peralatan fotosintesis sel Synechocystis dipengaruhi oleh m-Tyr
Bakteri mengatur laju pertumbuhan mereka dengan memodifikasi aktivitas dan metabolisme seluler mereka. Untuk menguji efek m- Tyr pada pertumbuhan dan fisiologi Synechocystis , kami menganalisis akumulasi klorofil, protein total, dan aktivitas fotosintesis pada sel yang diobati dengan m -Tyr versus sel yang tidak diobati. Rasio F v / F m , yang sesuai dengan efisiensi kuantum PSII maksimum [ [ 23 ] ], ditemukan jauh lebih rendah pada sel yang diobati dengan m- Tyr daripada pada sel yang tidak diobati (yaitu, tumbuh dalam kondisi yang sama tanpa analog asam amino nonproteogenik) (Gbr. 2A ). Analisis ini menunjukkan pengurangan sekitar 84% dan 96% F v / F m pada sel yang tumbuh di media yang mengandung 12,5 dan 50 μ m m- Tyr, masing-masing. Nilai rata-rata kandungan klorofil total juga tampak sedikit lebih rendah pada sel Synechocystis yang diobati dengan konsentrasi m- Tyr yang lebih tinggi (yaitu, ≥ 12,5 μ m ), meskipun perbedaan ini tidak signifikan secara statistik (Gbr. 2B ). Kami selanjutnya menganalisis efek m- Tyr pada evolusi O 2 dan laju penyerapan sel Synechocystis . Penambahan m- Tyr (yaitu, 12 dan 25 μ m ) ke media pertumbuhan terutama memengaruhi aktivitas fotosintesis, seperti yang ditunjukkan oleh laju evolusi O 2 yang berkurang pada intensitas cahaya yang berbeda (yaitu, 20 hingga 2000 μE·m −2 ·s −2 ) (Gbr. 2C ). Aktivitas pernapasan (yaitu, laju penyerapan O 2 dalam gelap) juga tampak terpengaruh, meskipun tidak signifikan secara statistik (Gbr. 2C ).
Gambar 2
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Aktivitas fotosintesis dan kadar protein total menurun pada sel Synechocystis yang diberi m -Tyr . Nilai F v / F m (A), klorofil (B), dan laju evolusi/penyerapan O 2 (C) dianalisis pada sel Synechocystis sp. PCC6803 yang tumbuh tanpa atau dengan adanya m- Tyr, seperti yang ditunjukkan pada setiap grafik. Nilai tersebut merupakan rata-rata dari tiga (A dan B) dan lima (C) replikasi biologis. Batang galat menunjukkan satu simpangan baku (SD). Tanda bintang menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik antara sel yang diberi dan tidak diberi (uji- t Student ; tidak signifikan (ns), * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001).
Pengaruh m- Tyr pada morfologi sel sianobakteri dan sistem membran tilakoid dianalisis dengan mikroskop elektron. Kami melihat bahwa sel Synechocystis yang diobati dengan m -Tyr menunjukkan sistem membran yang berubah, dengan ruang antar tilakoid yang tidak memiliki struktur intraseluler yang jelas (Gbr. 3 ). Kami selanjutnya mencatat keberadaan badan granular di semua sel yang diobati dengan m -Tyr (Gbr. 3 ). Granula subseluler ini kemungkinan berhubungan dengan glikogen [ [ 24 ] ], sianofisin (polimer yang tidak larut dalam air yang terdiri dari asam amino Asp dan Arg) [ [ 25 ] ], atau polihidroksibutirat [ [ 26 ] ], yang semuanya diketahui terakumulasi dalam sel Synechocystis yang tumbuh dalam kondisi stres [ [ 24 , 26 , 27 ] ]. Yang perlu diperhatikan, fenotipe serupa diamati pada kloroplas Arabidopsis thaliana , tanaman darat model, yang menunjukkan berkurangnya penumpukan grana dan akumulasi partikel lipoprotein yang dikenal sebagai plastoglobuli setelah perlakuan m- Ty [ [ 12 ] ].
Gambar 3
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Morfologi sel yang berubah dari sel Synechocystis tumbuh dengan adanya m- Tyr. Mikrograf elektron transmisi representatif dari sel Synechocystis . Sel Synechocystis sp. PCC6803 tumbuh dalam medium YBG11 yang mengandung berbagai konsentrasi m- Tyr (0–25 μm ) , seperti yang ditunjukkan dalam gambar. Variasi morfologi dan komposisi Synechocystis dianalisis dengan mikroskop elektron transmisi. C, karboksim; CP, butiran sianofisin; G, butiran glikogen; IM, membran plasma bagian dalam; OM, membran plasma bagian luar; TM, membran tilakoid. Batang mewakili 0,5 μm.
Profil asam amino dari sel Synechocystis yang tidak diobati dan yang diobati dengan m -Tyr
Cyanobacteria dan tanaman tampaknya mengandung kadar Phe bebas yang jauh lebih rendah daripada organisme non-fotosintetik. Menurut data dari Brey et al . [ [ 28 ] ], Synechocystis mengandung sekitar 4,0 μm Phe bebas. Berdasarkan analisis kami, kadar Phe bebas dalam Synechocystis yang tidak diobati diperkirakan sebesar 12,0 ± 0,5 μm , menurun hingga sekitar setengah konsentrasi ini dengan adanya 12,5 μm m -Tyr dalam media pertumbuhan (Tabel 1 ). Demikian pula, sel tanaman mengandung sekitar 15 μm Phe bebas, seperti yang dilaporkan oleh Zer et al . [ [ 12 ] ] dan Voll et al . [ [ 29 ] ]. Temuan ini selaras dengan penelitian sebelumnya yang menunjukkan kadar yang sebanding dari berbagai asam amino bebas, termasuk Phe, dalam spesies cyanobacteria dan tanaman [ [ 30 ] ].
Tabel 1. Kadar relatif asam amino bebas pada sel Synechocystis yang diberi perlakuan m -Tyr vs. yang tidak diberi perlakuan . Residu asam amino aromatik ditu
SD , simpangan baku ( n = 2).
b Asam amino Ala dan Gly, Citrulline dan Asn, Gln dan Asn, serta Ornithine dan Lys dikuantifikasi bersama.
c Tidak terdeteksi oleh metode analisis.
Selain Phe, analisis kandungan asam amino bebas dalam Synechocystis yang diobati dengan m -Tyr mengungkapkan pengurangan kadar banyak asam amino setelah penambahan 12,5 μ m m -Tyr ke dalam media pertumbuhan (Tabel 1 ). Ini termasuk asam amino bermuatan positif His dan Lys, asam amino bermuatan negatif Asp, asam amino polar Ser, Thr, dan Asn, asam amino hidrofobik Ala, Val, Ile, Leu, dan Met, serta Gly dan Pro. Khususnya, asam amino yang paling tereduksi tampaknya termasuk asam amino aromatik Phe, Tyr, dan Trp. Gln (polar) dan produk siklus urea dari Arg, citrulline dan ornithine, agaknya ditemukan terakumulasi ke kadar yang lebih tinggi dalam sel yang diobati dengan m -Tyr, sedangkan kadar Arg (bermuatan positif) dan Glu (bermuatan negatif) adalah setara antara sel yang tidak diobati dan yang diobati dengan m -Tyr (Tabel 1 ). Asam amino bebas Cys terakumulasi pada tingkat rendah di berbagai spesies cyanobacteria dan tumbuhan [ [ 30 ] ]. Karena Cys mudah teroksidasi menjadi sistin, kami menghilangkan pengukuran Cys untuk menyederhanakan metode GC–MS. Secara keseluruhan, data tersebut mungkin terkait dengan perubahan metabolisme asam amino, sintesis protein, dan/atau degradasi protein setelah penambahan m -Tyr ke dalam media pertumbuhan.
Analisis pengaruh m- Ty pada translasi cyanobacterial menggunakan uji profil polisom
Berbagai data menunjukkan bahwa bakteri yang tumbuh lambat sering kali menunjukkan tingkat sintesis protein yang berkurang sambil menunjukkan kandungan karbohidrat dan lipid yang lebih tinggi daripada sel-sel yang tumbuh lebih cepat [ [ 31 ] ]. Demikian pula, sel Synechocystis yang tumbuh dengan adanya m -Tyr menunjukkan kandungan protein total yang berkurang rata-rata ketika tumbuh dengan adanya 12,5 μ m m- Tyr dalam media pertumbuhan (Gbr. 4 ). Kami sebelumnya menunjukkan bahwa toksisitas m- Tyr pada tanaman darat terkait, setidaknya sebagian, dengan penggabungan analog nonprotein ini selama penerjemahan protein organel tanaman alih-alih asam amino Phe asli [ [ 12 , 21 ] ]. Untuk menganalisis apakah toksisitas m- Tyr pada Synechocystis terkait dengan efisiensi penerjemahan yang berubah, kami menggunakan metode pembuatan profil polisom yang dimodifikasi untuk mempelajari status penerjemahan mRNA dalam sel yang diobati versus yang tidak diobati. Sel sianobakteri yang tumbuh dengan atau tanpa m -Tyr (yaitu, 10 atau 50 μm ) dilisiskan dengan French press dan dimuat ke dalam gradien sukrosa 10–50%. Setelah ultracentrifugasi, gradien dikumpulkan menjadi 13 fraksi, dan RNA dan protein diisolasi dari fraksi monosom dan polisom (Gbr. 5 ). Uji profil polisom menunjukkan bahwa kadar relatif monosom, polisom, dan mRNA bebas dalam sel Synechocystis yang diobati dengan m- Tyr secara umum lebih rendah daripada sel yang tidak diobati (Gbr. 5 ). Data ini selanjutnya menunjukkan bahwa ekspresi gen dan aktivitas translasi memang dipengaruhi oleh penambahan m- Tyr ke dalam media pertumbuhan.
Gambar 4
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Kadar protein total yang berkurang pada sel Synechocystis yang diobati dengan m -Tyr . Kadar protein total dianalisis pada sel Synechocystis sp. PCC6803 yang tumbuh tanpa atau dengan 3,12 dan 12,5 μ m m- Tyr, seperti yang ditunjukkan dalam bagan. Nilai tersebut merupakan rata-rata dari tiga replikasi biologis. Batang galat menunjukkan satu simpangan baku (SD). Tanda bintang menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik antara sel yang diobati dan yang tidak diobati (uji- t Student ; tidak signifikan (ns), * P ≤ 0,05).
Gambar 5
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Uji profil polisom sel Synechocystis yang tumbuh tanpa atau dengan kehadiran m- Tyr. Untuk percobaan profil polisom, kultur Synechocystis berumur 5 hari yang tumbuh tanpa atau dengan kehadiran (10 dan 50 μm ) m – Tyr dipanen dengan sentrifugasi dan dilakukan profil polisom dengan ultracentrifugasi gradien densitas sukrosa. Fraksi gradien sukrosa yang sesuai dengan monosom dan polisom digabungkan, dan total protein diekstraksi untuk analisis proteomik. Semua kultur dan percobaan profil polisom diulang tiga kali untuk memastikan integritas hasil. Histogram menggambarkan prosedur percobaan yang umum.
Penggabungan residu m- Ty ke dalam proteom cyanobacterial
Pertumbuhan lambat dan perubahan morfologi sel Synechocystis yang diobati dengan m -Tyr dapat dikaitkan dengan perubahan fungsi seluler akibat penggabungan analog Phe ini ke dalam proteom cyanobacterial, seperti yang ditunjukkan sebelumnya dengan tanaman Arabidopsis yang diobati dengan m -Tyr [ [ 12 , 21 ] ]. Untuk menguji asumsi ini, kami melakukan analisis proteomik terhadap total protein yang diperoleh dari fraksi monosom dan polisom sel Synechocystis yang dikultur dalam media pertumbuhan (YBG11) yang disuplemen dengan m- Tyr (Gbr. 5 ). Untuk mengidentifikasi potensi peristiwa penggabungan m- Tyr dalam protein cyanobacterial, kami mencari substitusi Phe-ke-Tyr, karena tirosin dan m- Tyr berbagi massa yang identik. Secara keseluruhan, sekitar 10% residu Phe yang diketahui, yang diidentifikasi oleh analisis MS protein dalam sel yang diobati dengan m -Tyr, digantikan oleh ( m -)Tyr, sedangkan kurang dari 1% protein dalam sel kontrol (tumbuh tanpa m- Tyr) mengandung substitusi Phe-ke-( m -)Tyr (Tabel 2 ). Data spektrometri massa dari tiga analisis proteomik independen sel Synechocystis yang tumbuh tanpa (kontrol) atau dengan adanya 10 dan 50 μ m m- Tyr dirangkum dalam Gambar 6 .
Tabel 2. Persentase Phe tersubstitusi oleh residu ( m -)Tyr dalam proteom bakteri.
Gbr. 6
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Studi proteomik menunjukkan bahwa m- Tyr salah dimasukkan sebagai pengganti Phe. Analisis proteomik Synechocystis tumbuh tanpa atau dengan adanya m- Tyr. Setelah ekstraksi total protein dari fraksi gradien sukrosa, yang sesuai dengan monosom dan polisom kultur berusia 5 hari, peptida tripsin dari total protein sel dianalisis dengan LC–MS/MS. Data dianalisis untuk penggantian Phe-ke-Tyr. (A) Jumlah relatif penggantian Phe-ke-( m- )Tyr per protein. (B) Ontologi protein dari protein yang mengandung pertukaran m- Tyr. Nilai-nilai tersebut adalah rata-rata dari tiga replikasi biologis. Batang galat menunjukkan satu deviasi standar (SD).
Frekuensi tertinggi yang diamati terkait dengan protein yang mengandung antara 1 dan 4 substitusi per polipeptida (Gbr. 6A ). Khususnya, jumlah substitusi Phe-ke-( m -)Tyr ditemukan lebih tinggi di hadapan 10 μ m m- Tyr daripada dalam sel Synechocystis yang tumbuh di hadapan 50 μ m analog nonprotein (Gbr. 6A dan Tabel 2 ). Kami berspekulasi bahwa data ini terkait dengan aktivitas translasi yang berkurang, seperti yang tampak oleh mRNA dan ribosom yang berkurang oleh uji profil polisom (Gbr. 5 ). Analisis ontologi protein menunjukkan bahwa kelompok utama protein yang mengandung jumlah substitusi Phe > ( m- )Tyr tertinggi meliputi subunit ribosom (27,9%), protein fotosintetik (21,9%), berbagai enzim yang terlibat dalam metabolisme sel (13,3%), dan banyak protein lain yang saat ini tidak memiliki fungsi yang ditetapkan (yaitu, ‘tidak diketahui’; 17,1%) (Gbr. 6B ). Hasil ini mungkin berkorelasi dengan tingkat ekspresi gen dan/atau pergantian yang relatif lebih tinggi yang terkait dengan berbagai protein fotosintetik dan subunit ribosom dalam sel [ [ 32 ] ].
Pengurangan toksisitas m- Tyrus oleh asam amino aromatik asli Phe
Sebelumnya, telah ditunjukkan bahwa co-aplikasi asam amino proteinogenik, terutama Phe, bersama dengan m -Tyr, dapat memulihkan sebagian cacat pertumbuhan dan perkembangan yang terkait dengan tanaman darat [ [ 12 , 14 , 21 ] ]. Demikian pula, ketika Phe ditambahkan ke media pertumbuhan cyanobacterial (YBG11), sel-sel ditemukan kurang rentan terhadap toksisitas m- Tyr (Gbr. 7A ), sedangkan penambahan asam amino aromatik asli Tyr tidak memiliki, atau hanya efek minor, pada toksisitas m- Tyr untuk Synechocystis (Gbr. 7B ). Penambahan Phe atau Tyr pada konsentrasi yang setara dengan m- Tyr (yaitu, 6,25 μ m ) tidak memiliki (atau hanya efek minor) pada pertumbuhan Synechocystis . Karena kadar Phe bebas endogen tidak diubah secara signifikan oleh m -Tyr, masuk akal bahwa kedua molekul (yaitu, Phe dan m -Tyr) diimpor oleh protein transpor yang sama. Interaksi kompetitif ini mungkin menyiratkan bahwa ketika diterapkan secara eksogen, Phe mengalahkan analog toksik m -Tyr, mengurangi konsentrasi intraselulernya dan dengan demikian mengurangi efek berbahayanya. Pertanyaan yang tersisa adalah apakah Phe dan m -Tyr dimasukkan ke dalam proteom cyanobacterial oleh enzim yang sama, seperti yang sebelumnya dicatat untuk m -Tyr pada organisme lain [ [ 12 , 20 , 21 ] ].
Gbr. 7
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Phe eksogen dapat memulihkan sebagian efek toksisitas m -tirosin pada pertumbuhan Synechocystis sp. PCC6803. Efek asam amino aromatik fenilalanin (Phe; panel A) dan tirosin (Tyr; panel B) pada toksisitas yang dimediasi m -tirosin pada sianobakteri diselidiki. (A) Laju pertumbuhan sel Synechocystis dianalisis tanpa atau dengan adanya m -tirosin dan/atau Phe yang ditambahkan ke media pertumbuhan, seperti yang ditunjukkan dalam histogram. (B) Demikian pula, laju pertumbuhan sel Synechocystis dianalisis tanpa atau dengan adanya m -tirosin dan/atau Tyr yang ditambahkan ke media pertumbuhan, seperti yang ditunjukkan dalam histogram. Laju pertumbuhan ditentukan dengan mengukur kepadatan sel pada OD = 730 nm. Gambar di atas setiap histogram menunjukkan kultur Synechocystis setelah 5 hari pengobatan tanpa atau dengan adanya residu aromatik dan m -tirosin. Mikrograf menunjukkan sel setelah 7 hari. Nilai tersebut merupakan rata-rata dari tiga replikasi biologis. Batang galat menunjukkan satu deviasi standar (SD). Batang mewakili 1,0 cm.
Peran aminoasil-tRNA sintetase dalam toksisitas cyanobacteria yang dimediasi m-Tyr
Aminoasil-tRNA sintetase (aaRS) biasanya adalah enzim yang sangat spesifik, mengenali asam amino dan tRNA yang sesuai. Namun, beberapa aaRS, khususnya untuk asam amino dengan rantai samping yang sama dapat menunjukkan spesifisitas silang atau “mischarging,” di mana mereka dapat menempelkan asam amino yang sama ke tRNA untuk asam amino ‘asli’ yang spesifik. Mischarging seperti itu sering kali menjadi sumber kesalahan dalam sintesis protein dan dapat berkontribusi pada toksisitas, seperti dalam kasus analog asam amino seperti m -Tyr [ [ 12 , 20 , 21 ] ]. Telah ditetapkan bahwa enzim PheRS yang berbeda dapat mengkatalisis pengisian tRNA Phe dengan analog m -Tyr yang tidak serumpun [ [ 12 , 20 , 21 ] ]. Enzim PheRS yang berbeda di alam menunjukkan spesifisitas dan afinitas yang berbeda-beda untuk mis-aminoacylating m -Tyr ke tRNA Phe . Berdasarkan ‘hiper’-sensitivitas Synechocystis terhadap m- Tyr, kami mempertimbangkan bahwa enzim PheRS cyanobacterial mungkin juga menunjukkan lebih sedikit selektivitas terhadap Phe atau beberapa kekurangan dalam aktivitas peptidil-tRNA hidrolase (PTH) intrinsik yang dikaitkan dengan aminoasil-RS kanonik.
Kelas II tipe kanonik fenilalanil-tRNA sintetase dalam E. coli ( Ec.PheRS ) atau B. subtilis ( Bs.PheRS ) terbuat dari dua subunit α dan dua subunit β, yang terdiri dari 11 domain struktural yang diketahui [ [ 33 , 34 ] ] (Gbr. S1A,B dan S2A ). Sistron PheS dan PheT dalam kedua bakteri ini ditemukan bersama-sama pada operon yang sama, sedangkan dalam Synechocystis sp. PCC6803 gen PheS dan PheT ditranskripsi secara independen oleh lokus gen yang berbeda, yaitu, sll0454 dan sll1553 , masing-masing. Penjajaran sekuens dan perbandingan subunit α dan β dari PheRS dalam E. coli ( Ec ), B. subtilis ( Bs ), dan Synechocystis sp. PCC6803 ( Syn ) mengindikasikan bahwa protein bakteri tampak terkonservasi dengan baik dan memiliki arsitektur yang sama (Gbr. S1 ). Meskipun demikian, perubahan spesifik pada asam amino kunci pada akhirnya dapat memengaruhi mekanisme kontrol kualitas PheRS cyanobacterial. Di sini, kami menganalisis apakah penggantian enzim PheRS dari Synechocystis dengan enzim B. subtilis dapat mengurangi toksisitas m- Tyr. Untuk tujuan ini, klaster gen PheS – T B. subtilis disisipkan ke dalam lokus PheS di Synechocystis , seperti gen PheS dan PheT yang ditemukan pada unit operonik tunggal, bersama dengan gen Kanamycin-resistant ( KanR ) (Gbr. S2B ). Syn.PheT kemudian dimutasi dengan penyisipan gen Spectinomycin-resistant ( SpecR ) ke dalam lokus gen (Gbr. S2B ). Setelah pemisahan lengkap transgen dalam garis mutan ganda Synechocystis ΔPheS:ΔPheT (Gbr. S2B,C ), tidak memiliki efek (atau hanya ringan) pada laju pertumbuhan garis transforman yang mengekspresikan enzim Bs .PheRS (Gbr. S2D ; Synechocystis ΔPheS:ΔPheT:BsPheRS ). Hasil ini menunjukkan bahwa penggantian fungsional Syn .PheRS oleh enzim bakteri ‘kanonik’ gagal mengurangi toksisitas m- Tyr.
Efek fitotoksik m -Tyr pada Synechocystis dalam kondisi pertumbuhan fotomiksotrofik
Kami menganggap bahwa efek toksik m -Tyr mungkin berhubungan dengan perubahan ekspresi protein yang terkait dengan biogenesis aparatus fotosintesis. Synechocystis sp. PCC 6803 dapat melakukan bentuk kemoheterotrofik yang unik, yang memerlukan kondisi cahaya rendah untuk mempertahankan pertumbuhan yang bergantung pada glukosa dalam gelap, suatu kondisi yang disebut sebagai pertumbuhan ‘fotomiksotrofik’ [ [ 22 ] ]. Pertumbuhan di bawah fotomiksotrofik ‘gelap’ lambat dibandingkan dengan kultur yang tumbuh di bawah cahaya. Kami menyelidiki apakah sianobakteri yang tumbuh di bawah kondisi pertumbuhan kemoheterotrofik dapat berperilaku serupa dengan sel bakteri non-fotosintesis, seperti B. subtilis atau E. coli . Synechocystis sp. Sel PCC 6803 tumbuh dalam cahaya dan aktivitas respirasi atau fotosintesisnya diukur pada berbagai intensitas cahaya, serta dalam kondisi pertumbuhan fotomiksotrofik (yaitu, dengan adanya glukosa 10 mm , dengan periode cahaya pendek 50 μE·m −2 ·s −2 intensitas cahaya selama 5,0 menit setiap 24 jam). Data menunjukkan bahwa m -Tyr memiliki efek penting pada laju pertumbuhan dan pembelahan sel baik pada sel yang tumbuh dalam kondisi terang maupun ‘gelap’ (Gbr. 2C , Gbr. S3A,B ). Hal ini tampak dari laju evolusi O 2 dan penyerapan sel tipe liar atau mutan yang tumbuh dalam kondisi gelap maupun terang ( ΔPheS:ΔPheT:BsPheRS ) (Gbr. S3C,D ). Data ini menunjukkan bahwa hipersensitivitas cyanobacteria terhadap m -Tyr tidak dapat dikaitkan hanya dengan penggabungannya ke dalam protein terkait fotosintesis atau perubahan aktivitas fotosintesis.
Analisis tingkat mutasi spontan yang memberikan resistensi Synechocystis terhadap m -Tyr
Synechocystis diinkubasi dalam media pertumbuhan yang mengandung berbagai konsentrasi analog asam amino nonproteinogenik m -Tyr, berkisar dari 5 hingga 25 μ m . Jumlah sel yang bertahan hidup (yaitu, persentase sel hidup) ditentukan oleh flow cytometry (Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS). Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar S4A , berdasarkan sinyal fluoresensi (Gambar S4B, C ), fraksi sel yang bertahan hidup berkurang secara signifikan ketika konsentrasi m -Tyr ditingkatkan, dengan sekitar 30% mortalitas sel pada 5 μ m dan di atas 75% mortalitas pada 25 μ m m -Tyr. Kami selanjutnya memperkirakan rasio sel resisten yang tumbuh pada konsentrasi 50 μ m m -Tyr. Sel-sel tersebut awalnya dikultur dalam media cair yang mengandung 50 μ m m -Tyr selama 2 minggu untuk menginduksi resistensi. Setelah itu, sel-sel tersebut dipelet dan digoreskan ke pelat agar untuk mengukur koloni yang resisten. Setelah 2–3 bulan, beberapa sel yang resistan tampak sebagai koloni-koloni tersendiri pada lempeng. Berdasarkan analisis ini, laju mutasi untuk resistensi m -Tyr 50 μ m ditetapkan sebesar ~ 1,0 × 10 −3 .
Resistensi terhadap m -Tyr pada E. coli muncul melalui mutasi pada gen yang mengkode transporter, kemungkinan mengubah penyerapan atau pengeluaran analog nonproteinogenik yang beracun ini [ [ 16 ] ]. Untuk mengeksplorasi apakah mekanisme serupa ada pada Synechocystis, kami memulai penyaringan genetik untuk mutan yang resistan terhadap m -Tyr. Data awal mengungkapkan beberapa galur Synechocystis yang resistan , termasuk mutan yang terpengaruh pada transporter asam amino ABC Sll0224 dan transporter Ssr6089 (Tabel S1 ). Temuan ini sangat penting mengingat kadar Phe yang rendah secara alami pada cyanobacteria dan tanaman (masing-masing ~ 12–15 μ m ). Mutan tambahan mengandung mutasi pada gen yang terlibat dalam ekspresi gen, seperti RNA polimerase dan histidin kinase, serta pada DegS, suatu protease serin yang memainkan peran penting dalam respons stres dengan mengatur kontrol kualitas protein (Tabel S1 ).
Diskusi
Analog nonprotein m- Ty sangat beracun bagi sel cyanobacteria
m -Tyr adalah analog asam amino nonproteinogenik yang dibentuk oleh oksidasi langsung residu Phe atau disintesis secara enzimatis pada spesies tanaman tertentu (misalnya, rumput) dan mungkin pada beberapa bakteri [ [ 18 ] ]. Ini dapat menjadi racun bagi berbagai organisme, termasuk bakteri gram negatif dan gram positif, jamur, dan hewan pada konsentrasi tinggi, yaitu, dalam kisaran milimolar [ [ 11 , 12 , 14 , 19 , 21 , 35 , 36 ] ] (Gbr. 1 ). Namun, ia bertindak (pada tingkat mikromolar rendah) sebagai alelokimia yang kuat, yang memengaruhi perkecambahan, pembentukan bibit, dan pertumbuhan dan perkembangan awal pada tanaman darat [ [ 12 , 14 , 36 ] ]. Di sini, kami menunjukkan bahwa, tidak seperti spesies bakteri nonfotosintetik lainnya, cyanobacteria sangat sensitif terhadap m- Tyr. Zat ini menghambat pertumbuhan dan merusak fisiologi Synechocystis dan cyanobacteria lain pada konsentrasi ≥ 3 μ m , sementara menyebabkan kematian sel pada konsentrasi yang lebih tinggi (yaitu, ≥ 12,5 μ m ) (Gbr. 1 dan Gbr. S3 ). Namun, dasar molekuler untuk toksisitas m- Tyr dan perbedaan sensitivitas di antara berbagai organisme belum sepenuhnya dipahami.
Toksisitas m- Tyrus pada cyanobacteria dikaitkan dengan perubahan aktivitas translasi
Sel hidup harus mengkatalisis sintesis protein mereka dengan akurasi tinggi untuk memastikan aliran informasi yang tepat dari gen ke protein. Titik kendali mutu yang kritis adalah selektivitas aminoasil-tRNA sintetase dalam menyediakan asam amino yang diaktifkan dengan benar (bermuatan) yang melekat pada tRNA untuk translasi protein. Studi genetik dan biokimia telah menunjukkan bahwa m- Ty dapat dimasukkan ke dalam proteom hewan [ [ 19 ] ], bakteri [ [ 37 ] ], dan organel tanaman [ [ 12 ] ], dan dengan demikian kemungkinan menginduksi respons protein yang tidak terlipat. Efek ini kemungkinan dimediasi oleh mis-aminoasilasi m- Ty ke dalam PheRS alih-alih residu Phe asli [ [ 12 , 20 , 21 ] ]. Kehadiran m- Tyr dalam proteom cyanobacteria dikonfirmasi oleh studi proteomik, yang selanjutnya menunjukkan bahwa substitusi Phe-ke-( m- )Tyr yang lebih umum terjadi pada protein aparatus translasi dan fotosintesis dalam sel Synechocystis sp. PCC6803 (Gbr. 6 , Tabel 2 ). Dengan demikian, aktivitas fotosintesis (Gbr. 2 ) dan profil ribosom (Gbr. 5 ) terutama terpengaruh dalam sel cyanobacteria yang diobati. Ini berkorelasi dengan pertumbuhan yang berkurang, peningkatan kematian sel, dan perubahan morfologi Synechocystis yang tumbuh dengan adanya m- Tyr (Gbr. 1 dan 3 , Gbr. S3 ). Selain itu, analisis morfologi sel Synechocystis , tumbuh dengan dan tanpa m -Tyr, mengungkapkan keberadaan badan granular (glikogen, sianofisin, atau polihidroksibutirat), yang diketahui terakumulasi dalam kondisi stres atau sintesis protein yang berubah (Gbr. 3 ). Diharapkan bahwa penggabungan analog nonprotein kemungkinan menginduksi agregasi protein dan respons protein yang tidak terlipat, seperti yang ditunjukkan sebelumnya [ [ 16 ] ]. Demikian pula, tanaman darat dengan cacat dalam degradasi protein abnormal dan salah lipat dalam kloroplas (yaitu, mutan mesin protease FtsH) menunjukkan peningkatan kepekaan terhadap m- Tyr [ [ 12 ] ].
Memahami peningkatan kerentanan cyanobacteria terhadap m- Ty, dibandingkan dengan bakteri non-fotosintetik
E. coli resisten terhadap kadar m -Tyr yang tinggi, tetapi mutan yang terpengaruh dalam mekanisme kontrol protein menunjukkan sensitivitas yang lebih tinggi terhadap analog nonprotein ini. Toksisitas m- Tyr lebih lanjut tampaknya terkait erat dengan metabolisme asam amino aromatik yang berubah dalam E. coli [ [ 16 ] ]. Homeostasis asam amino seluler dipertahankan melalui impor, ekspor, dan metabolisme asam amino, serta regulasi sintesis dan degradasi protein. Sejalan dengan hipotesis ini adalah perubahan yang diamati dalam kadar asam amino dan akumulasi pada cyanobacteria yang diobati dengan m -Tyr (Tabel 1 ). Meningkatnya kadar m -Tyr dalam beberapa asam amino berkorelasi dengan berkurangnya kadar ribosom dan polisom (dan akibatnya sintesis protein berkurang) (Gbr. 5 ) serta kandungan protein yang lebih rendah (Gbr. 4 ) terlihat pada sel Synechocystis yang diobati dengan m -Tyr . Sayangnya, dan meskipun telah dilakukan berbagai upaya, analisis kami gagal mendeteksi kadar Phe dalam sel cyanobacteria. Meskipun demikian, efek toksisitas m- Tyrofoam diketahui berkurang ketika analog nonprotein diberikan ke media pertumbuhan bersamaan dengan Phe, tetapi tidak dengan Tyr (Gbr. 7 ).
Seperti berbagai mikroorganisme autotrofik lainnya, Synechocystis dapat mensintesis 22 asam amino sendiri (20 l – dan dua d -asam amino), yang diperlukan untuk biosintesis protein. Ini dapat diproduksi oleh hidrolisis protein dan daur ulang asam amino bebas, dan oleh fermentasi atau reaksi metabolisme yang mengarah pada sintesis asam amino yang berbeda [ [ 38 ] ]. Pada cyanobacteria, biosintesis dan degradasi asam amino diatur ketat oleh ketersediaan nitrogen dan karbon [ [ 39 ] ]. Synechocystis secara teratur ditemukan di lingkungan miskin nitrogen dan dengan demikian menunjukkan kumpulan asam amino bebas intraseluler yang terbatas [ [ 40 ] ]. Sebagian besar enzim dalam Synechocystis yang terlibat dalam reaksi metabolisme yang sangat diatur dan penting ini memiliki kesamaan yang tinggi dengan yang ditemukan di E. coli [ [ 38 ] ]. Kami mempertimbangkan bahwa peningkatan toksisitas m- Tyr terhadap cyanobacteria (dan tanaman) mungkin berhubungan dengan kadar Phe bebas (masing-masing sekitar 12 hingga 15 μ m ). Khususnya, dalam B. subtilis , kadar Phe bebas diperkirakan sekitar 500 kali lebih tinggi daripada dalam sel cyanobacteria atau tanaman (~ 2 mm , [ [ 41 ] ]), yang mungkin menunjukkan sensitivitasnya yang lebih rendah terhadap m -Tyr. Selain itu, kami mengamati penurunan kadar residu aromatik Phe, Tyr, dan Trp setelah penambahan m -Tyr. Temuan ini menunjukkan perubahan dalam jalur shikimate metabolik utama, yang selanjutnya dapat meningkatkan efek toksik m -Tyr pada tanaman [ [ 12 ] ] dan cyanobacteria (Tabel 1 ).
Penentu kunci lain dari toksisitas m -Tyr melibatkan substitusinya untuk Phe dalam berbagai protein cyanobacterial. (Kesalahan) penggabungan analog asam amino bergantung terutama pada pemuatan nonspesifiknya ke dalam molekul tRNA yang sesuai, suatu aktivitas yang terkait dengan aminoasil-tRNA sintetase (RS), dan tingkat relatif asam amino asli dan isoform nonproteinogeniknya [ [ 12 , 21 , 42 ] ]. Kesalahan penggabungan m- Tyr ke dalam proteom sel ditunjukkan pada berbagai organisme, termasuk bakteri, hewan, dan tumbuhan [ [ 12 , 16 , 19 ] ]. Hal ini bergantung pada pemuatan analog nonprotein ke dalam tRNA Phe [ [ 20 , 21 ] ]. Enzim PheRS dibagi menjadi tiga kelompok utama (Gbr. S1 dan S2A ): (a) enzim heterotetramerik bakteri yang terdiri dari dua subunit alfa (α; dikodekan oleh gen PheS ) dan dua subunit beta (β; dikodekan oleh gen PheT ); (b) enzim tipe archaea/eukariotik dengan enzim heterotetramerik (αβ)2 yang mirip; dan (c) bentuk monomerik yang ditemukan dalam organel (mitokondria dan plastida) eukariota, yang tampaknya secara evolusioner terkait dengan subunit bakteri PheS/PheT [ [ 20 , 21 ] ] (Gbr. S1 dan S2A ). B. subtilis dan E. coli [ [ 16 , 37 ] ] menunjukkan sensitivitas rendah terhadap m- Ty, bahkan pada konsentrasi 1,5~2,0 mm ( Gbr. 1B ). Sementara PheRS bakteri dan enzim sitosolik dalam sel eukariotik menunjukkan spesifisitas tinggi untuk Phe, dan dapat secara efektif menghidrolisis m -Tyr yang dimuat secara tidak benar, paralog PheRS organel (mitokondria dan plastidial) tampak lebih terdegenerasi dan menunjukkan kekurangan dalam mekanisme kontrol kualitasnya [ [ 20 , 21 ] ]. Demikian pula, telah ditunjukkan bahwa mutan E. coli PheRS menunjukkan sensitivitas yang lebih tinggi terhadap m -Tyr [ [ 37 ] ]. Dengan demikian kami mempertimbangkan bahwa sensitivitas cyanobacteria yang lebih tinggi terhadap m- Tyr mungkin berhubungan dengan enzim PheRS-nya. Meskipun analisis gen PheS dan PheT tidak mengungkapkan perbedaan yang jelas antara enzim dalam Synechocystisdan yang ada di E. coli atau B. subtilis (Gbr. S1 ), tetap mungkin bahwa variasi dalam urutan asam amino dapat memengaruhi mekanisme kontrol kualitas enzim PheRS pada organisme yang berbeda. Untuk menguji hipotesis ini, kami mengganti enzim asli di Synechocystis dengan enzim B. subtilis (Gbr. S2B,C ). Namun, mengganti enzim Syn.PheRS asli dengan enzim B. subtilis tidak mengurangi toksisitas m- Tyr pada sel sianobakteri yang ditransformasi (Gbr. S2D ). Upaya untuk memperkenalkan Syn.PheRS ke dalam E. coli dan/atau B. subtilis untuk menguji apakah Syn.PheRS memberikan sensitivitas yang lebih tinggi terhadap m -Tyr sedang dilakukan.
Kami juga mempertimbangkan bahwa efek m -Tyr berhubungan dengan aktivitas fotosintesis yang berubah, karena tingkat pergantian yang tinggi dari beberapa enzim fotosintesis utama [ [ 43 , 44 ] ], dan karenanya meningkatkan tingkat kesalahan penggabungan analog asam amino ke dalam protein ini. Ini juga disarankan oleh data proteomik (Gbr. 6 ), sistem membran tilakoid yang tidak normal (Gbr. 3 ), dan profil ribosom yang berubah (Gbr. 5 ). Namun, analisis efek m -Tyr pada sel yang tumbuh terang atau ‘gelap’ menunjukkan bahwa toksisitas m -Tyr tidak dapat dikaitkan hanya dengan aktivitas fotosintesis yang berubah (Gbr. S3C,D ). Oleh karena itu, masih mungkin bahwa meningkatnya kepekaan sianobakteri terhadap m- Tyr dikaitkan dengan berbagai faktor lain, seperti rendahnya tingkat endogen asam amino aromatik Phe pada organisme fotosintetik, yang mengakibatkan tingginya tingkat penggabungan analog, meningkatnya tingkat impor m -Tyr ke dalam sel bakteri, dan/atau metabolismenya di dalam sel, yakni berkurangnya kemampuan untuk memproses analog menjadi produk sampingan yang tidak atau kurang beracun.
Resistensi terhadap m- Tyr pada E. coli diamati berkembang melalui mutasi pada gen yang mengkode transporter, kemungkinan memodifikasi penyerapan atau pengeluaran analog nonprotein yang beracun [ [ 16 ] ]. Hipotesis ini saat ini sedang diselidiki melalui penyaringan genetik untuk sel Synechocystis yang resistan terhadap m- Tyr . Data awal menunjukkan adanya beberapa galur Synechocystis yang resistan , yang mencakup mutan yang terpengaruh pada transporter asam amino ABC (Sll0224) dan protein transporter Ssr6089 (Tabel S1 ). Mutan lain termasuk gen yang terlibat dalam ekspresi gen (yaitu, RNA polimerase dan histidin kinase), dan DegS yang mungkin terlibat dalam mekanisme kontrol kualitas protein (Tabel S1 ).
Singkatnya, data kami menunjukkan bahwa, tidak seperti bakteri non-fotosintetik seperti B. subtilis dan E. coli , sianobakteri sangat rentan terhadap m -Tyr, bahkan pada konsentrasi mikromolar. Berdasarkan analisis kami, efek ini terutama terkait dengan sintesis protein yang terganggu karena penggabungan m -Tyr alih-alih residu Phe asli ke dalam proteom sianobakteri. Kadar Phe bebas yang relatif rendah pada sianobakteri dan tanaman diperkirakan menghasilkan tingkat penggabungan analog asam amino yang tinggi ke dalam proteom sianobakteri dibandingkan dengan bakteri lain (non-fotosintetik), seperti E. coli dan B. subtilis . Substitusi semacam itu kemungkinan mengarah pada agregasi protein dan respons protein yang tidak terlipat. Mayoritas protein yang ditemukan mengandung m -Tyr dikategorikan sebagai subunit ribosom atau berbagai protein fotosintetik, bersama-sama mencakup sekitar setengah dari protein yang ditemukan mengandung substitusi Phe > ( m -)Tyr. Kami menduga bahwa efek-efek ini terkait dengan tingkat ekspresinya yang tinggi (atau tingkat pergantian yang cepat). Mengapa sianobakteri lebih sensitif terhadap m -Tyr? Jelas, menumbuhkan sel dalam gelap atau mengganti enzim PheRS asli dengan enzim B. subtilis tidak menghilangkan efek m -Tyr. Oleh karena itu, kami mengusulkan bahwa efek toksisitas m -Tyr berkorelasi dengan kombinasi faktor, termasuk perubahan homeostasis asam amino (terutama jalur shikimat), penyerapan m -Tyr oleh berbagai transporter, seperti yang ditunjukkan oleh penyaringan genetik awal, dan kemungkinan juga berkurangnya kemampuan sianobakteri untuk memetabolisme analog menjadi produk sampingan yang tidak beracun.
Bahan dan metode
Strain dan kondisi pertumbuhan
Synechocystis sp. PCC 6803 (strain Kazusa) [ [ 45 ] ] digunakan dalam semua percobaan, termasuk yang melibatkan garis mutan yang mapan (yaitu, dalam gen PheS dan PheT ). Kultur sianobakteri tumbuh dalam medium YBG11 [ [ 46 ] ] pada suhu 30 °C, intensitas cahaya 60 μmol·foton·m −2 ·s −1 , di bawah pengocokan konstan (100 rpm). Bacillus subtilis tumbuh pada medium minimal S7 [ [ 47 ] ]. Sel tumbuh pada suhu 37 °C dengan pengocokan konstan (150 rpm). Untuk analisis efek asam amino pada pertumbuhan dan fisiologi bakteri, media dilengkapi dengan berbagai asam amino (seperti yang ditunjukkan dalam setiap pengujian). m- Tyr (Sigma Chem. Corp. St. Louis, MO, AS; nomor kat. SML3708) ditambahkan ke media pada konsentrasi seperti yang ditunjukkan dalam setiap uji eksperimental. Antibiotik (yaitu, Kanamisin atau Spectinomycin) ditambahkan ke media pertumbuhan (YBG11) pada konsentrasi akhir 50 μg·mL −1 , seperti yang ditunjukkan dalam setiap prosedur eksperimental. Laju pertumbuhan diperkirakan berdasarkan kepadatan sel (yaitu, OD = 600 nm untuk B. subtilis atau E. coli , dan OD = 730 nm untuk sianobakteri), menggunakan Bio-spektrofotometer Carry 300 (Varian Medical Systems, Hansen Way, Palo Alto, CA, AS). Setiap percobaan diulang setidaknya tiga kali.
Penentuan konsentrasi klorofil secara spektrofotometri dan analisis aktivitas fotosintesis
Ekstraksi dan analisis klorofil dilakukan seperti yang dilaporkan sebelumnya [ [ 48 ] ]. Singkatnya, sel Synechocystis dipeletkan dengan sentrifugasi (10 menit pada 16.000 g ) dan disuspensikan kembali dalam 100% metanol. Setelah inkubasi 30 menit dalam gelap, supernatan bening diperoleh setelah sentrifugasi (10 menit pada 16.000 g ). Konsentrasi klorofil ‘a’ dihitung dengan absorbansi supernatan pada 665 nm. Pengukuran fluoresensi dilakukan terutama dengan mengikuti metode yang dijelaskan oleh Campbell et al . [ [ 49 ] ] menggunakan fluorometer PAM (Imaging-PAM, Walz, Effeltrich, Jerman). Sel beradaptasi dengan gelap selama 5 menit, setelah itu tingkat fluoresensi minimal ( F o ) direkam saat lampu pengukur dinyalakan. Tingkat fluoresensi maksimum ( F m ) dicapai dengan menambahkan 10 μ m DCMU ke sampel.
Mutagenesis dan transformasi enzim PheRS B. subtilis ke dalam sel Synechocystis
Unit operon PheS – PheT dari B. subtilis diperoleh dengan PCR. Primer yang digunakan untuk menghasilkan konstruksi DNA yang berbeda tercantum dalam Tabel S2 . Konstruksi PCR dikloning ke dalam vektor pGEM-T Easy (Promega A1380, Madison, WI, AS) dan diverifikasi integritasnya dengan sekuensing DNA (Fasilitas Teknologi Genom HUJI, Yerusalem, Israel). Klaster gen PheS – PheT dikloning bersama dengan gen yang resistan terhadap Kanamisin ( KanR ). Gen yang resistan terhadap Spektinomisin (SpecR) dikloning ke dalam pGEM-T, sehingga dapat digunakan untuk insersi spesifik ke dalam lokus gen Syn.PheT . Untuk tujuan ini , konstruksi gen tersebut mengandung sekuens homolog dari gen Synechocystis PheS dan PheT untuk memungkinkan rekombinasi spesifik untuk gen PheS di Synechocystis dengan gen B. subtilis klaster gen PheS-PheT dan penyisipan SpecR ke dalam lokus PheT . Konstruksi tersebut ditransformasikan ke dalam Synechocystis , pada dasarnya seperti yang dijelaskan sebelumnya [ [ 50 ] ].
Ekstraksi dan analisis RNA
Ekstraksi RNA dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [ [ 51 ] ]. Sampel RNA kemudian diperlakukan dengan DNase, menggunakan Turbo-DNA RNase-free (Life Technologies, Grand Island, NY, AS). Untuk transkripsi balik, kami menggunakan RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, Wilmington, DE, AS, no. kat. K1622), sesuai dengan petunjuk pabrik. PCR dilakukan dengan primer spesifik yang dirancang untuk gen PheS dan PheT dari Synechocystis (masing-masing UniProts Q55187 dan P74296 ) dan B. subtilis (masing-masing UniProts P17921 dan P17922 ). Gen housekeeping RnpA (UniProt Q55005 ) digunakan sebagai kontrol internal untuk Synechocystis [ [ 51 ] ] (Tabel S2 ).
Analisis mikroskopis sel Synechocystis
Untuk analisis makroskopis, sel berumur 5 hari dipanen dengan sentrifugasi (3500 g , 10 menit) dan difiksasi dalam 2% paraformaldehida dan 2,5% glutaraldehida dalam buffer kakodilat 0,1 M (pH 7,4) selama 5 jam pada suhu 25 °C, diikuti dengan inkubasi pada suhu 4 °C selama 16 jam. Sel dibilas 4 kali (masing-masing 10 menit) dalam buffer kakodilat 0,1 M , dengan sentrifugasi singkat (6000 g , 10 detik) di antara pencucian. Pascafiksasi dan pewarnaan dilakukan dengan 1% OsO4 dan 1,5% K3 [ Fe(CN) 6 ] dalam buffer kakodilat 0,1 M selama 1 jam pada suhu 25 °C, diikuti dengan empat pencucian dalam buffer yang sama. Sampel didehidrasi dalam rangkaian etanol (30–95%, masing-masing 10 menit), diikuti oleh tiga kali pencucian dalam etanol 100% (masing-masing 20 menit) dan dua kali pencucian dalam propilena oksida (masing-masing 10 menit). Sel kemudian diinfiltrasi dengan peningkatan konsentrasi resin Agar 100 dalam C3H6O ( 25 %, 50%, 75%, dan 100%) selama 16 jam per langkah, dibenamkan dalam resin segar, dan dipolimerisasi pada suhu 60 °C selama 48 jam. Potongan sangat tipis (80 nm) dipotong menggunakan mikrotom Leica Reichert Ultracut S dengan pisau berlian, dipasang pada kisi tembaga 200-mesh, dan diwarnai secara berurutan dengan uranil asetat dan timbal sitrat (masing-masing 10 menit). Pencitraan dilakukan dengan Tecnai 12 TEM (120 kV; Philips, Eindhoven, Belanda), dilengkapi dengan kamera Phurona dan perangkat lunak RADIUS (Emsis GmbH, Münster, Jerman), di Unit Bio-Pencitraan, Institut Ilmu Hayati, Universitas Ibrani Yerusalem.
Analisis asam amino bebas
Kadar asam amino bebas ditentukan oleh penganalisa asam amino (AminoLab, Rehovot, IL, AS), secara umum seperti yang dijelaskan sebelumnya [ [ 52 ] ]. Sebelum dianalisis, asam amino dipisahkan pada kolom pertukaran ion dan kemudian diderivatisasi dengan ninhidrin (derivatisasi pasca-kolom). Asam amino dideteksi pada 440 dan 570 nm dan diidentifikasi (dan diukur) terhadap standar asam amino yang tersedia secara komersial yang disuntikkan bersama ke dalam penganalisa asam amino.
Pengujian profil polisom
Polisom diisolasi seperti yang dijelaskan sebelumnya [ [ 53 ] ]. Singkatnya, 400 mL kultur Synechocystis berumur 5 hari ditumbuhkan tanpa atau dengan m- Tyrus (10 dan 50 μm ) . Sel dipanen dengan sentrifugasi (8000 g selama 10 menit pada 4 °C) dan disuspensikan kembali dalam Buffer ekstraksi (20 mm Tris /HCl pH 8,0, 10 mm magnesium asetat, 20 mm amonium klorida, 1 mm DTT , 0,25 mm kloramfenikol , dan 200 μg·mL −1 heparin) (heparin DTT dan kloramfenikol ditambahkan tepat sebelum digunakan). Sel-sel dilisiskan dengan French Press (dua kali pada 20.000 PSI), dan supernatan yang jernih diperoleh dengan sentrifugasi pada 30.000 g (30 menit pada 4 °C). Supernatan dikumpulkan dan dibagi menjadi 600 μL alikuot. Gliserol ditambahkan ke setiap alikuot hingga konsentrasi akhir 5% (V/V), dan tabung disimpan pada suhu -80 °C hingga digunakan. Untuk analisis polisom, 300 μL alikuot dimuat ke dalam gradien sukrosa (10–50%) yang disiapkan dalam Buffer ekstraksi (20 mm Tris /HCl pH 8,0, 10 mm Mg (CH 3 COO) 2 , 20 mm NH 4 Cl , 1 mm DTT , 0,25 mm kloramfenikol dan 200 μg·mL −1 heparin) dan disentrifugasi selama 2 jam pada 27.320 g (4 °C).
Analisis proteomik
Untuk analisis protein, 100 μL dari setiap sampel dicampur dengan 800 μL aseton dingin dan diinkubasi pada suhu -70 °C selama 1 jam, diikuti dengan sentrifugasi (13.000 g , 10 menit). Pelet dikeringkan dengan udara dan disuspensikan kembali dalam buffer denaturasi (8 m urea, 10 m m DTT, 25 m m Tris/HCl, pH 8,0) selama 30 menit pada suhu ruangan (~ 25 °C), kemudian dialkilasi dengan 55 m m iodoacetamide selama 30 menit dalam gelap. Sampel diencerkan 8 kali lipat dengan 25 m m Tris/HCl (pH 8,0), dicerna semalaman pada suhu 37 °C dengan tripsin yang dimodifikasi dengan tingkat sekuensing (0,4 μg per sampel), diasamkan (0,3% asam format), dihilangkan garamnya pada StageTips C18 buatan sendiri, dan dilarutkan kembali dalam 0,1% asam format. Konsentrasi peptida diperkirakan pada 280 nm, dan 0,35 μg disuntikkan per proses. LC–MS/MS dilakukan pada spektrometer massa Q Exactive-HF (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AS) yang digabungkan dengan Dionex Ultimate 3000 UHPLC. Peptida dipisahkan pada kolom C18 25 cm (ID 75 μm, 2 μm, 100 Å) menggunakan gradien asetonitril 4–80% (0,1% FA) selama 80 menit. Pemindaian MS1 (300–1650 m/z) diperoleh pada resolusi 60.000, diikuti oleh MS/MS dari 15 prekursor teratas (HCD, NCE 27, jendela isolasi 1,6 m/z, resolusi 15.000, pengecualian dinamis 20 detik). Data diperoleh dengan Xcalibur dan dianalisis menggunakan metamorpheus v1.0.1 [ [ 54 ] ] terhadap proteom Synechocystis sp. PCC 6803 (UniProt, 3507 entri), termasuk penemuan PTM dengan substitusi F → Y yang diaktifkan. Analisis dilakukan di Stein Family Mass Spectrometry Center, Universitas Ibrani Yerusalem.