Abstrak
Brucella abortus adalah penyebab salah satu zoonosis yang paling umum di seluruh dunia. Kami baru-baru ini menemukan dua efektor yang ditranslokasi, NyxA dan NyxB, yang berkontribusi pada tahap akhir siklus infeksi. Meskipun strukturnya telah terpecahkan, pentingnya interaksi dan keadaan dimeriknya masih belum diketahui. Kami menemukan bahwa NyxA dan NyxB berinteraksi secara langsung dan bahwa dimerisasinya penting untuk fungsinya selama infeksi. Kami menunjukkan bahwa bentuk monomerik dari efektor Nyx masih berinteraksi dengan target seluler inangnya, deSUMOylase sentrin-specific protease 3 (SENP3) tetapi kurang mampu daripada dimer untuk mendelokalisasi SENP3 dari nukleolus. Studi ini memberikan wawasan baru tentang interaksi molekuler intra dan inter-efektor selama patogenesis Brucella .
Singkatan
A , angstrom
BSA , albumin serum sapi
Ya , Dalton
DMEM , media Eagle yang dimodifikasi Dulbecco
DTT , ditiotreitol
EDTA , éthylènediaminetétraacétique
E-Glu , asam glutamat
HBSS , Larutan Garam Seimbang Hanks
HS , serum kuda
IPTG , Isopropil ß- d -1-thiogalactopyranoside
L-Leu , leusin
MOI , multiplisitas infeksi
OD , kepadatan optik
PBS , garam penyangga fosfat
PFA , paraformaldehida
SAXS , hamburan sinar-X sudut kecil
SEC-MALS , kromatografi pengecualian ukuran yang digabungkan dengan hamburan cahaya multi-sudut
SENP3 , protease spesifik sentrin 3
TSB , kaldu kedelai tripsin
W-Trp , triptofan
Y-Tyr , tirosin
Patogen bakteri sering kali bergantung pada translokasi protein efektor melalui sistem sekresi khusus untuk memodulasi fungsi seluler dan menyebabkan penyakit. Fungsi efektor ini dan interaksi molekulernya sangat penting untuk patogenesis. Kami baru-baru ini mengidentifikasi dua efektor, yang disebut NyxA (BAB1_0296; UniProt Q2YPD9 ) dan NyxB (BAB1_1101; UniProt Q2YPZ9 ) dari Brucella abortus , yang menargetkan kompartemen sitosol dan nuklir selama infeksi [ [ 1 ] ].
Brucella adalah penyebab salah satu zoonosis paling umum di seluruh dunia [ [ 2 ] ], menghasilkan dampak ekonomi yang parah pada ternak di daerah endemis [ [ 3 ] ] dan berdampak pada satwa liar [ [ 4 ] ]. Brucella adalah bakteri Gram-negatif dengan potensi patogenik tinggi yang bergantung pada sistem sekresi tipe 4 untuk membangun ceruk multiplikasi intraseluler dan memodulasi fungsi seluler dan imun [ [ 5 , 6 ] ]. Setelah diambil oleh sel inang, Brucella lolos dari kerusakan dari jalur endositosis dan membangun kompartemen yang cocok untuk multiplikasi yang berasal dari retikulum endoplasma [ [ 7 , 8 ] ]. Selama waktu ini, Brucella mengeluarkan dan mentranslokasi beberapa efektor yang memodulasi jalur host spesifik untuk mendorong patogenesis, termasuk trafficking intraseluler dan jalur sekresi [ [ 9 – 12 ] , [ 13 ] ], fungsi retikulum endoplasma [ [ 14 – 16 ] ], metabolisme [ [ 17 , 18 ] ], dan respons inflamasi [ [ 19 , 20 ] ]. NyxA dan NyxB telah terbukti berinteraksi dengan deSUMOylase SENP3 host dan memediasi delokalisasinya dari nukleolus ketika diekspresikan secara ektopik dan selama infeksi [ [ 1 ] ]. Konsekuensi dari delokalisasi ini masih belum diketahui tetapi SENP3 diperlukan untuk multiplikasi intraseluler penuh Brucella [ [ 1 ] ].
Struktur NyxB dipecahkan pada resolusi 2,5 Å menggunakan kristalografi sinar-X, yang mengungkapkan bahwa ia mengadopsi lipatan α–β campuran, yang terdiri dari lima untai-β dan enam heliks-α. Pencarian homolog struktural menggunakan server DALI dan klasifikasi lipatan EMBL tidak mengungkapkan kesamaan yang signifikan, yang menjadikan NyxB sebagai prototipe struktural dalam keluarga proteinnya [ [ 1 ] ]. Struktur NyxA disimpulkan oleh pemodelan homologi, dan kedua efektor Nyx terbukti membentuk dimer dalam larutan [ [ 1 ] ]. Dalam penelitian ini, kami bertujuan untuk menyelidiki interaksi molekuler yang berpotensi memediasi fungsi efektor ini. Kami menemukan bahwa NyxA dan NyxB dapat menjadi bagian dari kompleks yang sama dalam sel dan konformasi dimernya penting untuk perekrutan SENP3 selama infeksi.
Bahan dan metode
Sel, kondisi kultur, dan perawatan obat
Sel HeLa-CCL-2 (RRID: CVCL_0030) dan makrofag RAW 264.7 TIB-71 (RRID: CVCL_0493) dari ATCC ditumbuhkan dalam DMEM yang ditambah dengan 10% serum sapi fetus, pada suhu 37 °C dengan 5% CO 2 . Sel-sel tersebut diperiksa secara rutin untuk mengetahui tidak adanya kontaminasi Mycoplasma . Sel-sel ini tidak diautentikasi sebagai sel yang dibeli langsung dari ATCC pada tahun 2023.
Vektor ekspresi eukariotik dan bakteri
Konstruksi NyxA dan NyxB dalam vektor pENTRY-myc atau HA dan pET151D telah dijelaskan sebelumnya [ [ 1 ] ]. Konstruksi NyxA-L93E dan NyxB-L97E diperoleh melalui mutagenesis terarah menggunakan primer pada Tabel 1 melalui mutagenesis terarah, mengikuti protokol PrimeSTAR Max DNA Polymerase (Takara Bio).
Tabel 1. Daftar primer yang digunakan dalam penelitian ini.
Strain, kultur, dan infeksi Brucella
B. abortus 2308 digunakan dalam penelitian ini. Strain tipe liar dan turunannya dikultur dalam kaldu kedelai tripsin cair dan agar. Strain ini tahan terhadap asam nalidiksat.
Vektor TEM
Konstruksi NyxA-L93E dan NyxB-L97E diperoleh melalui mutagenesis terarah menggunakan primer pada Tabel 1 di pFlagTEM152-NyxA atau NyxB [ [ 1 ] ]. Setelah verifikasi dengan sekuensing, plasmid dimasukkan ke dalam B. abortus 2308 melalui konjugasi dengan Escherichia coli S17.
Vektor 4HA
Konstruksi NyxA-L93E dan NyxB-L97E diperoleh melalui mutagenesis terarah situs pBBR1MCS-4-4HA-NyxA atau NyxB [ [ 1 ] ], menggunakan primer pada Tabel 1. Setelah verifikasi dengan sekuensing, plasmid dimasukkan melalui konjugasi ke dalam mutan B. abortus 2308 yang masing-masing tidak memiliki nyxA atau nyxB .
Untuk semua infeksi, percobaan dilakukan seperti yang dijelaskan dalam [ [ 1 ] ]. Secara singkat, sel eukariotik disemai pada penutup kaca dalam pelat 24-sumur 18 jam sebelum infeksi pada 2 × 104 sel per sumur. Kultur bakteri diinokulasi dalam 2 mL kaldu kedelai tripsin (TSB) dan diinkubasi selama 18 jam sambil dikocok semalaman pada suhu 37 °C. Kepadatan optik kultur ditentukan pada 600 nm untuk mengencerkan kultur guna memperoleh multiplisitas infeksi (MOI) 1 : 500 dalam media kultur sel. Pelat yang diinokulasi disentrifugasi pada 400 g selama 10 menit untuk memulai kontak bakteri-sel dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 °C dan 5% CO 2 agar infeksi dimulai. Sel kemudian dicuci tiga kali dengan DMEM dan diinkubasi dengan media lengkap yang ditambah dengan gentamisin (50 μg·mL −1 ) untuk membunuh bakteri ekstraseluler. Setelah 1 jam, konsentrasi gentamisin dikurangi menjadi 10 μg·mL −1 . Pada titik waktu yang berbeda, penutup kaca difiksasi untuk imunopewarnaan seperti dijelaskan di bawah ini.
Uji translokasi TEM1
Sel RAW 264.7 disemai dalam pelat 96-sumur pada 0,5 × 104 sel per sumur semalaman. Sel diinokulasi pada MOI 500 dan disentrifugasi pada 400 g selama 10 menit pada suhu 4 °C untuk mencegah fagositosis dan menyinkronkan infeksi. Sel yang terinfeksi kemudian diinkubasi selama 45 menit pada suhu 37 °C dengan 5% CO2 . IPTG pada 1 mm dipertahankan selama infeksi untuk menginduksi ekspresi fusi TEM. Setelah inkubasi 45 menit, sel dicuci dengan DMEM dan diinkubasi dengan media yang mengandung gentamisin (50 μg·mL −1 ) selama 1 jam, ketika konsentrasi antibiotik dikurangi menjadi 10 μg·mL −1 . Pada 24 jam pasca infeksi, campuran CCF2 disiapkan seperti yang dijelaskan dalam protokol Life Technologies (Carlsbad, CA, AS) dan ditambahkan, bersama dengan probenesid 2,5 mm ( untuk mengurangi ekspor CCF2 ke dalam sel). Sel diinkubasi selama 2 jam pada suhu ruangan dalam keadaan gelap. Sel dicuci dengan PBS, difiksasi menggunakan 3,2% PFA, dan segera dianalisis dengan mikroskopi konfokal (Nikon AR1-Si + , Tokyo, Jepang).
Ekspresi dan pemurnian protein
Mutan Nyx dimurnikan menggunakan protokol yang sama seperti yang sebelumnya dijelaskan untuk NyxA dan NyxB tipe liar [ [ 1 ] ]. Bakteri termokompeten E. coli BL21-DE3-pLysS ditransformasi dengan vektor ekspresi yang berbeda dan tumbuh dalam media kaldu lisogenik (LB) hingga OD 600 = 0,6. Ekspresi mereka diinduksi dengan 1 m m IPTG pada 37 °C selama 3 jam dengan pengocokan. Sel kemudian dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 5000 g selama 15 menit dan disuspensikan kembali dalam buffer lisis 20 m m Tris pH 8, 150 m m NaCl, 5% gliserol, 1% Triton X-100, 5 m m β-merkaptoetanol. Koktail antiprotease EDTA-Free dan 30 U·mL −1 benzonase ditambahkan. Sonikasi digunakan untuk memecah sel dan serpihan dihilangkan dengan sentrifugasi pada 20.000 g selama 30 menit pada suhu 4 °C. Semua protein rekombinan dimurnikan dengan kromatografi menggunakan kolom Hitrap Chelating HP bermuatan Nikel (GE Healthcare, Chicago, IL, AS). Bahan yang tidak terikat dicuci menggunakan larutan yang terdiri dari Tris 20 mm pH 8, NaCl 300 mm , Imidazol 25 mm , β-merkaptoetanol 5 mm , dan gliserol 10%. Ini diikuti dengan pencucian tambahan dengan 2 volume kolom NaCl 1 m . Elusi setiap protein Nyx dicapai menggunakan gradien imidazol 25–500 mm pada 8 volume kolom, dan dengan menggabungkan semua fraksi puncak. Akhirnya, tag His dibelah dengan protease TEV dalam 1 m m DTT dan 0,5 m m EDTA dalam buffer dialisis semalam yang terdiri dari 20 m m Tris pH 8 dan 150 m m NaCl.
Langkah pemurnian tambahan dilakukan dengan kromatografi pengecualian ukuran (Superdex 200 HiLoad 16/600, GE Healthcare) yang diseimbangkan dalam 20 m m Tris pH 8, 150 m m NaCl, dan 5% gliserol. Sampel dipekatkan pada konsentrator Vivaspin 5 kDa, dan kemurniannya diverifikasi dengan SDS/PAGE.
Pengecualian ukuran hamburan cahaya multi-sudut
Metode-metode ini sebelumnya telah dijelaskan dalam [ [ 21 ] ]. Kromatografi pengecualian ukuran (SEC) dilakukan dengan Superdex S200 Increase 10/300 GL atau Superdex 75 Increase 10/300 GL (Cytiva, Marlborough, MA, AS) yang diseimbangkan dengan buffer Tris pH 8 20 mm, yang mengandung 150 mm NaCl , dan gliserol 5%. Laju alir 0,5 mL·menit −1 digunakan pada suhu 20 °C. Protein disuntikkan pada konsentrasi 0,4 hingga 11 mg·mL −1 (50 μL). Deteksi hamburan cahaya laser multi-sudut (MALS) daring dilakukan dengan detektor DAWN-HELEOS II (Wyatt Technology Corp., Santa Barbara, CA, AS) menggunakan laser yang memancarkan pada 690 nm. Konsentrasi protein diukur secara daring menggunakan pengukuran indeks bias diferensial (RI) dengan detektor Optilab T-rEX (Wyatt Technology) dan kenaikan RI dn/dc sebesar 0,185 mL·g −1 . Massa molekular rata-rata berat (Mw) dihitung menggunakan perangkat lunak astra (Wyatt Technology Corp.).
Transfeksi
Semua sel ditransfeksi sementara menggunakan JetOPTIMUS (Polyplus, Illkirch, Prancis) sesuai dengan petunjuk produsen selama 18 jam.
Mikroskopi imunofluoresensi
Penutup gelas dicuci dua kali dengan PBS, difiksasi pada titik waktu yang diinginkan dengan AntigenFix (MicromMicrotech France, Brignais, France) atau PFA 3,2% (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA) selama 20 menit, lalu dicuci lagi empat kali dengan PBS. Penutup gelas kemudian diinkubasi dengan PBS yang mengandung 0,5% Triton X-100 selama 10 menit untuk membuat sel permeabil, dan pemblokiran dilakukan dengan 0,3% triton, 2% bovine serum albumin (BSA), dan 10% horse serum (HS) dalam PBS selama 20 menit.
Perlu dicatat, deteksi efektor berlabel HA yang ditranslokasi dicapai dengan permeabilisasi sel dengan 0,3% triton dalam PBS selama 10 menit dan meminimalkan pelabelan protein intravakuolar. Pemblokiran dilakukan selama 15 menit dengan 2% BSA dan 10% HS dalam PBS tetapi tanpa triton.
Semua antibodi primer (Tabel 2 ) yang diencerkan dalam 2% BSA dan 10% HS diinkubasi pada suhu 4 °C semalaman di ruang lembap. Penutup gelas dicuci dua kali dalam PBS dan diinkubasi selama 1 jam tambahan pada suhu ruangan dalam gelap dan di ruang lembap dengan campuran antibodi sekunder. Akhirnya, penutup gelas dicuci dua kali dalam PBS dan sekali dalam air ultramurni sebelum dipasang pada slide dengan ProLongGold (Life Technologies). Sel yang diberi label imun dicitrakan dengan mikroskop pemindai laser terbalik Confocal Zeiss LSM980 NLO dan Leica SP5 dan dianalisis menggunakan imagej .
Tabel 2. Daftar antibodi yang digunakan dalam penelitian ini.
Ko-imunopresipitasi
Sel HeLa dikultur dalam cawan yang diberi perlakuan kultur sel berukuran 100 x 20 mm pada 1,5 x 106 sel per cawan semalaman dan ditransfeksi sementara dengan JetOPTIMUS (Polypus). Sebanyak 10 μg DNA ditambahkan per cawan dan diinkubasi pada suhu 37 °C, 5% CO2 selama 18 jam. Untuk meminimalkan toksisitas, media diganti 4 jam setelah transfeksi. Setelah 18 jam, cawan diletakkan di atas es dan dicuci dua kali dengan PBS dingin. Sel dikumpulkan dengan pengikis sel dan disentrifugasi pada 80 g pada suhu 4 °C selama 5 menit. Lisis sel dan pemrosesan untuk ko-imunopresipitasi dilakukan seperti yang dijelaskan dengan kit GFP-Trap (Chromotek, Rosemont, IL, AS) atau seperti yang dijelaskan untuk Pierce™ Anti-HA Magnetic Beads (Thermo Fisher, Waltham, MA, AS).
Pengujian tarik-turun
Pengujian pull-down dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [ [ 1 ] ]. Singkatnya, dengan dua protein murni, 50 μg protein rekombinan berlabel His diinkubasi dengan protein yang tidak berlabel selama 2 jam pada suhu 4 °C. Sampel kemudian diinkubasi dalam kolom aliran gravitasi (Agilent, Santa Clara, CA, AS) yang berisi 80 μL manik agarosa Ni-NTA (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) selama 1 jam. Kolom dicuci terlebih dahulu dalam air dan diseimbangkan terlebih dahulu dalam buffer kesetimbangan 20 m m Tris/HCl pH 7,5, 250 m m NaCl. Setelah diinkubasi dengan campuran protein, kolom dicuci tiga kali dalam buffer kesetimbangan yang dilengkapi dengan 25 m m imidazol dan tiga kali dalam buffer kesetimbangan saja. Protein dielusi dalam buffer kesetimbangan yang dilengkapi dengan 500 m m imidazol. Hasil divisualisasikan setelah pemisahan dengan SDS/PAGE dengan pewarnaan Coomassie.
Kuantifikasi lokalisasi SENP3
Analisis kolokalisasi untuk sel HeLa yang ditransfeksi dilakukan dengan citra khusus yang dikembangkan dalam [ [ 1 ] ]. Secara singkat, plugin tersebut mengelompokkan nukleus dan nukleolus sel dalam setiap citra, mengklasifikasikan sel ke dalam dua kelas menurut intensitas HA-NyxA/NyxB. Pengukuran koefisien korelasi Pearson antara sinyal SENP3 dan nukleolus serta antara sinyal SENP3 dan HA-NyxA/NyxB atau mutan diperoleh. Untuk setiap nukleus, rasio antara intensitas rata-rata sinyal SENP3 dalam nukleolus dan intensitas rata-rata sinyal SENP3 di luar nukleolus juga dihitung. Satu percobaan tunggal dilakukan secara buta untuk mengonfirmasi perolehan citra yang tidak bias. Plugin serupa digunakan untuk sel yang terinfeksi, yang juga dijelaskan dalam [ [ 1 ] ] dan menghitung koefisien korelasi Pearson antara sinyal SENP3 dan nukleolin yang ditemukan di setiap nukleus sel yang terinfeksi, yang dideteksi dengan fluoresensi DSRed bakteri. Setelah distribusi normal dikonfirmasi menggunakan uji normalitas Shapiro–Wilk, uji ANOVA satu arah dengan koreksi Tukey untuk beberapa perbandingan dilakukan. Untuk analisis yang melibatkan dua variabel independen, uji ANOVA dua arah dilakukan.
Hasil
NyxA dan NyxB berinteraksi in vitro dan selulo
Kami sebelumnya telah menunjukkan bahwa NyxA dan NyxB dapat secara efisien mendelokalisasi SENP3 dari nukleolus ketika diekspresikan secara individual secara ektopik dalam sel inang [ [ 1 ] ]. Namun, ketika diekspresikan bersamaan, mereka sepenuhnya terkolokalisasi [ [ 1 ] ] yang menunjukkan bahwa mereka berpotensi menjadi bagian dari kompleks yang sama. Untuk menentukan apakah kedua efektor ini dapat berinteraksi secara langsung, kami memurnikannya dan melakukan eksperimen pull-down in vitro . Kami menemukan bahwa His-NyxA dapat menarik NyxB yang dimurnikan dan tidak diberi tag (Gbr. 1A ) dan sebaliknya (Gbr. 1B ). Identitas pita yang divisualisasikan diverifikasi oleh spektrometri massa. Termoforesis skala mikro juga mengonfirmasi interaksi ini dan menentukan K D sebesar 482 ± 126 nm (Gbr. 1C ), yang menunjukkan kompleks afinitas yang agak rendah.
Gbr. 1
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Interaksi in vitro dan in cellulo antara NyxA dan NyxB. (A) Pull-down menggunakan NyxB murni terhadap His-NyxA yang diimobilisasi pada resin Ni NTA atau kebalikannya (B) His-NyxB yang diimobilisasi. Untuk keduanya, kolom kosong digunakan sebagai kontrol untuk pengikatan non-spesifik. Interaksi divisualisasikan dengan gel yang diwarnai biru coomassie ( N = 3, dengan masing-masing satu perwakilan ditampilkan). Fraksi flowthrough (FT), wash (W), dan elution (E) ditampilkan untuk setiap sampel, dan berat molekul ditunjukkan (kDa). NyxA dan NyxB yang dielusi ditunjukkan dengan panah hitam dan merah, masing-masing. Dalam (A) dan (B), panah hitam menunjukkan NyxA, dan panah merah menunjukkan NyxB. (C) Termoforesis skala mikro yang mengukur fraksi 20 nm NyxA murni yang diberi label dengan protein kit yang memberi label pengikatan RED-NHS terhadap peningkatan konsentrasi NyxB (6,67 nm hingga 219 μm ) . Data sesuai dengan rata-rata ± simpangan baku dari tiga eksperimen independen. Kd yang diperoleh diindikasikan. (D) Uji ko-imunopresipitasi (co-IP) dari sel yang mengekspresikan NyxA atau NyxB yang diberi label HA atau Myc menggunakan manik-manik magnetik anti-HA. Eksperimen ini diulang tiga kali, dan sebuah representatif diperlihatkan. Fraksi input dan co-IP diungkapkan menggunakan antibodi anti-Myc (atas) dan anti-HA (bawah). Berat molekul diindikasikan (kDa).
Untuk menentukan apakah NyxA dan NyxB juga dapat menjadi bagian dari kompleks yang sama dalam selulosa , kami mengekspresikannya secara ektopik dengan memanfaatkan versi protein yang ditandai yang berbeda dan melakukan percobaan ko-imunopresipitasi. Dengan menggunakan manik-manik magnetik HA, kami menemukan bahwa myc-NyxA dapat melakukan ko-imunopresipitasi dengan HA-NyxB dan, sebaliknya, myc-NyxB dapat melakukan imunopresipitasi dengan HA-NyxA (Gbr. 1D ). Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa NyxA dan NyxB berinteraksi bersama dan merupakan bagian dari kompleks yang sama dalam sel.
Karena jumlah Nyx yang ditranslokasi rendah selama infeksi, kami tidak dapat menguji interaksi ini secara langsung pada sel yang terinfeksi menggunakan uji biokimia. Meskipun demikian, hipotesis ini konsisten dengan fakta bahwa penghapusan nyxA dan nyxB menghasilkan fenotipe yang sama dengan penghapusan nyxA dan nyxB secara individual, dalam hal delokalisasi SENP3 dari nukleolus, menunjukkan bahwa tidak ada efek aditif dari dua penghapusan gen [ [ 1 ] ]. Lebih jauh lagi, NyxA dan NyxB yang ditranslokasi memiliki lokalisasi seluler yang setara pada sel yang terinfeksi (ko-lokalisasi dengan penanda seluler yang sama) seperti yang diamati menggunakan uji ligasi kedekatan dan tag HA/Flag [ [ 1 ] ]. Oleh karena itu, kami menyimpulkan bahwa NyxA dan NyxB kemungkinan merupakan bagian dari kompleks yang sama pada sel yang terinfeksi, yang bertanggung jawab atas delokalisasi SENP3 yang diamati pada tahap akhir infeksi.
Identifikasi asam amino kunci pada permukaan dimerisasi Nyx
Struktur NyxB mengungkap organisasi dimer, yang juga divisualisasikan oleh hamburan sinar-X sudut kecil (SAXS) dan kromatografi pengecualian ukuran yang digabungkan dengan hamburan cahaya multi-sudut (SEC-MALS) untuk NyxA dan NyxB [ [ 1 ] ]. Oleh karena itu, kami ingin menyelidiki apakah pembentukan dimer berkontribusi pada fungsi efektor ini. Untuk mulai mengatasi hal ini, pertama-tama kami mengidentifikasi asam amino utama yang terlibat dalam pembentukan dimer. Dimer NyxB bergantung pada interaksi resiprokal antara α4 dari satu subunit dan α6 dari subunit lainnya dan antara dua loop α4–β4 (Gbr. 2A ) Residu NyxB W89, Y93, L97 dari α4 dan E132 dari α6 berinteraksi bersama terutama melalui interaksi hidrofobik (Gbr. 2B ). Dengan menganalisis dimer model homologi NyxA yang dihasilkan sebelumnya [ [ 1 ] ], kami menemukan bahwa residu dan interaksi ini dilestarikan dalam NyxA, dengan residu yang sesuai adalah W85, Y89, L93, dan E128 (Gbr. 2C ). Untuk memfasilitasi mutagenesis, kami memilih untuk memutasi L93 dan E128 yang terletak di C-termini heliks α4 dan α6, masing-masing, bukan W85 dan Y89 yang diposisikan di tengah α4 (Gbr. 2B ). Untuk mengganggu antarmuka dimer, kami menghasilkan mutan NyxA berikut dengan mutagenesis yang diarahkan situs: L93E, E128L, dan mutan ganda. Kami dapat memurnikan ketiga mutan dan menganalisis keadaan oligomeriknya dengan kromatografi pengecualian ukuran yang digabungkan dengan SEC-MALS menggunakan Superdex 200 Increase 10/300 GL. Percobaan ini mengungkap bahwa mutan ganda dan NyxA-L93E dielusi sebagai monomer, sedangkan mutasi E128L tidak berdampak pada keadaan oligomerik protein yang dielusi (Gbr. 2D ). Untuk mengonfirmasi bahwa leusin ini penting untuk pembentukan dimer, kami juga menghasilkan mutan ekuivalen dalam NyxB (NyxB-L97E) dan menganalisis protein tipe liar dan mutan NyxA dan NyxB dengan SEC-MALS menggunakan Superdex 75 Increase 10/300 GL yang memberikan pemisahan yang lebih baik dalam kisaran berat molekul yang lebih rendah. Pengenalan mutasi L93E ke dalam NyxA dan L97E ke dalam NyxB mengakibatkan perubahan volume elusi dan massa molekul menurun hingga 15 dan 17 kDa, masing-masing, berbeda dengan protein tipe liar masing-masing (Gbr. 2E ). Hasil ini mengonfirmasi bahwa mutasi leusin ini memisahkan dimer, dan kedua mutan Nyx bersifat monomerik dalam larutan. Secara keseluruhan, hasil kami dengan jelas menetapkan bahwa dimer yang diamati dalam struktur NyxB adalah yang benar dan dilestarikan dalam NyxA tetapi juga bahwa mutan protein ini stabil sebagai monomer.
Gambar 2
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Analisis antarmuka dimer dan identifikasi asam amino kunci yang terlibat. (A) Struktur dimer NyxB. (B) Tampilan close-up residu yang terlibat dalam antarmuka homodimer NyxB. (C) Tampilan close-up residu yang terlibat dalam antarmuka homodimer model NyxA. pymol digunakan untuk membuat gambar untuk (A), (B), dan (C). (D) Kromatografi Pengecualian Ukuran dan Hamburan Cahaya Multi-Sudut (SEC-MALS) dari NyxA dan mutan. Elusi dipantau secara daring menggunakan hamburan cahaya laser multi-sudut dan refraktometri. Kurva menunjukkan kromatogram yang dipantau oleh pengukuran indeks bias diferensial. Garis horizontal di atas puncak menunjukkan massa molekul di seluruh puncak elusi yang dihitung dari hamburan cahaya statis, dan angka menunjukkan massa molekul rata-rata berat (kDa) dengan simpangan baku. Data mewakili dua eksperimen independen. (E) SEC-MALS dari NyxA dan NyxB (garis hitam) dan mutan monomerik masing-masing (garis krem). Berat molekul rata-rata dan simpangan baku yang ditentukan ditunjukkan. Data merupakan representasi dari dua eksperimen independen.
Nyx monomerik masih menargetkan nukleus dan merupakan bagian dari kompleks yang sama dengan SENP3 pada sel inang
Untuk menentukan dampak pencegahan dimerisasi Nyx, kami mengekspresikan NyxA-L93E dan NyxB-L97E monomerik berlabel myc secara ektopik dan memvisualisasikan lokalisasi mereka dalam kaitannya dengan Nyx tipe liar yang sesuai. Seperti yang dilaporkan sebelumnya untuk NyxA/B tipe liar, mutan monomerik masih terakumulasi dalam nukleus, dalam struktur berbintik (Gbr. 3A ). Secara konsisten, NyxA-L93E dan NyxB-L97E monomerik masih mengalami ko-imunopresipitasi ketika diekspresikan secara ektopik, yang menunjukkan bahwa mereka adalah bagian dari kompleks yang sama dalam sel inang (Gbr. 3B ). Karena pita non-spesifik dideteksi dengan antibodi anti-myc, kami mengonfirmasi tidak adanya pengikatan myc-Nyx monomerik ke manik-manik HA dalam sampel kontrol menggunakan antibodi anti-Nyx, yang mengenali NyxA dan NyxB (Gbr. 3B , gambar bawah).
Gambar 3
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
NyxA dan NyxB monomerik masih menargetkan nukleus dan merupakan bagian dari kompleks yang sama. (A) Gambar confocal representatif dari sel epitel yang ditransfeksi bersama yang menunjukkan di panel atas lokalisasi HA-NyxA (hijau) dalam kaitannya dengan myc-NyxA-L93E (abu-abu) dan, di panel bawah, HA-NyxB (hijau) dalam kaitannya dengan myc-NyxB-L97E (abu-abu) ( N = 1). Skala batang sesuai dengan 5 μm. (B) Uji ko-imunopresipitasi (co-IP) dari sel yang mengekspresikan NyxA-L93E atau NyxB-L97E yang ditandai dengan HA atau Myc. Fraksi input dan co-IP diungkapkan menggunakan anti-Myc (atas), anti-HA (tengah), dan antibodi anti-Nyx (bawah). Berat molekul ditunjukkan (kDa). Gambar sesuai dengan representatif dari tiga eksperimen independen.
Bahasa Indonesia: Untuk menilai apakah mutan Nyx monomerik masih mampu berinteraksi dengan target seluler SENP3 yang diidentifikasi sebelumnya, pertama-tama kami mengekspresikan versi myc-tagged dari setiap Nyx secara ektopik dan mengekspresikannya bersama dengan GFP-SENP3 atau GFP sendiri sebagai kontrol untuk pengikatan nonspesifik. Hasil kami menunjukkan ko-imunopresipitasi yang efisien dari NyxA dan NyxB serta mutan monomerik dengan GFP-SENP3, tetapi tidak dengan GFP sendiri (Gbr. 4A ). Untuk mengonfirmasi hasil ini, kami juga melakukan ko-imunopresipitasi endogen. Kedua mutan monomerik NyxA dan NyxB mampu melakukan ko-imunopresipitasi SENP3 endogen, seperti yang diamati sebelumnya untuk tipe liar (Gbr. 4B ). Bersama-sama, hasil kami mengonfirmasi bahwa NyxA dan NyxB monomerik masih berada dalam kompleks yang sama dengan SENP3 dalam sel inang.
Gambar 4
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
NyxA dan NyxB monomerik masih berinteraksi dengan SENP3. (A) Uji ko-imunopresipitasi (co-IP) menggunakan GFP-Trap, diinkubasi dengan lisat dari sel yang mengekspresikan GFP-SENP3 dan Myc-NyxA, NyxB, NyxA-L93E, atau NyxB-L97E. GFP digunakan sebagai kontrol untuk pengikatan non-spesifik. Input dan elusi co-IP diungkapkan menggunakan antibodi anti-Myc (bawah) dan antibodi anti-GFP (atas). Berat molekul ditunjukkan (kDa). N = 3 (ditunjukkan secara representatif). (B) Uji ko-imunopresipitasi (co-IP) menggunakan manik-manik magnetik anti-HA, diinkubasi dengan lisat dari sel yang mengekspresikan HA-NyxA, HA-NyxA-L93E, HA-NyxB, atau HA-NyxB-L97E. Sel yang ditransfeksi dengan vektor HA kosong digunakan sebagai kontrol untuk pengikatan nonspesifik. Input dan elusi co-IP diungkapkan menggunakan antibodi anti-HA (bawah) dan antibodi anti-SENP3 (atas). Berat molekul ditunjukkan (kDa). N = 3 (ditunjukkan secara representatif).
Dimerisasi NyxA/NyxB meningkatkan perekrutan SENP3
Selanjutnya kami menyelidiki apakah mutan monomerik NyxA/B masih merekrut SENP3, yang mengakibatkan akumulasinya di luar nukleolus. Kuantifikasi dengan mikroskopi menunjukkan bahwa mutan monomerik kurang efisien dalam mendelokalisasi SENP3 dari nukleolus (Gbr. 5A,B ) dan merekrutnya ke agregat subnukleus Nyx (Gbr. 5C ) ketika diekspresikan secara ektopik dalam sel inang. Mengingat hasil ini, kami menguji apakah perekrutan SENP3 terpengaruh dalam sel yang terinfeksi, memanfaatkan vektor pelengkap yang mengekspresikan versi tipe liar atau monomerik NyxA dan NyxB. Setelah 48 jam pascainfeksi, ekspresi versi monomerik NyxA dan NyxB tidak melengkapi fenotipe penghapusan masing-masing (Gbr. 6A ), yang mengonfirmasi dimerisasi Nyx penting untuk delokalisasi SENP3 selama infeksi. Yang penting, translokasi NyxA/B pada sel yang terinfeksi tidak dipengaruhi oleh mutasi residu yang terlibat dalam pembentukan dimer seperti yang divisualisasikan menggunakan versi berlabel 4HA dari mutan monomerik ini (Gbr. 6B ) atau diukur oleh uji translokasi β-laktamase TEM (Gbr. 6C ).
Gambar 5
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Dimerisasi NyxA dan NyxB meningkatkan perekrutan SENP3 saat diekspresikan secara ektopik dan selama infeksi. (A) Gambar mikroskopi konfokal representatif dari sel HeLa yang mengekspresikan vektor HA kosong, HA-NyxA, HA-NyxA-L93E, HA-NyxB, dan HA-NyxB-L97E. Nucleolin (abu-abu), SENP3 (magenta), dan HA (hijau) terungkap dengan antibodi spesifik. Percobaan diulang tiga kali, dan gambar dikuantifikasi dalam (B). Skala batang sesuai dengan 5 μm. (B) Kuantifikasi koefisien korelasi Pearson dari SENP3 versus nucleolin atau (C) SENP3 versus HA (lihat Bahan dan metode untuk deskripsi plugin). Data direpresentasikan sebagai rata-rata ± interval kepercayaan 95% dari tiga percobaan independen. Setiap percobaan diberi kode warna, dan semua kejadian yang dihitung ditampilkan. Data dianalisis menggunakan ANOVA satu arah. Tidak semua perbandingan ditampilkan. Semua sel yang dikuantifikasi ditampilkan dalam format Super Plot, dengan setiap warna mewakili eksperimen independen dan nilai rata-ratanya ( N = 3). *Menunjukkan P < 0,05; ** P < 0,01, dan **** P < 0,0001.
Gbr. 6
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Dimerisasi NyxA dan NyxB penting untuk delokalisasi SENP3 pada sel yang terinfeksi. (A) Kuantifikasi koefisien korelasi Pearson dari SENP3 versus nukleolin pada sel yang terinfeksi dengan berbagai galur B. abortus selama 48 jam. Galur yang digunakan meliputi tipe liar, mutan yang kekurangan nyxA atau nyxB , atau galur yang dilengkapi dengan NyxA dan NyxB atau NyxA-L93E monomerik atau NyxB-L97E monomerik. Data direpresentasikan sebagai rata-rata ± 95% interval kepercayaan dari empat eksperimen independen. Setiap eksperimen diberi kode warna, dan semua kejadian yang dihitung ditampilkan. Data dianalisis menggunakan ANOVA satu arah. ****Menunjukkan P < 0,0001 dan ns, tidak signifikan. Tidak semua perbandingan ditampilkan. Semua sel yang dikuantifikasi ditampilkan dalam format Super Plot, dengan setiap warna mewakili eksperimen independen dan rata-ratanya yang sesuai. (B) Gambaran konfokal sel HeLa yang terinfeksi dengan B. abortus Δ nyxA atau Δ nyxB yang mengekspresikan 4HA-NyxA atau 4HA-NyxB, masing-masing, dibandingkan dengan mutan monomerik masing-masing, 4HA-NyxA-L93E dan 4HA-NyxB-L97E. Bakteri divisualisasikan dengan DAPI dan fusi 4HA yang ditranslokasi dengan antibodi anti-HA (hijau). Pencitraan ini dilakukan sekali. Skala batang sesuai dengan 10 μm. (C) Analisis translokasi NyxA, NyxB, dan mutan monomerik yang difusi dengan laktamase TEM-1 setelah 24 jam infeksi makrofag RAW 264.7. Data sesuai dengan mean ± SD ( N = 3). ANOVA satu arah digunakan untuk perbandingan. Gambar representatif ditunjukkan, dengan sel CCF2-positif berwarna magenta, dan skala batang sesuai dengan 20 μm.
Diskusi
Kami telah menggunakan struktur kristal dimer NyxB sebagai templat untuk mempelajari peran dimerisasi protein Nyx. Studi mutagenesis dan biokimia kami menunjukkan bahwa dimer yang diamati dalam struktur NyxB adalah yang benar, karena mutasi antarmuka memengaruhi stabilitas dimer. Selain itu, kami menunjukkan bahwa mode perakitan dimer dilestarikan dalam dua protein Nyx. Dengan menggunakan ekspresi ektopik dan uji infeksi, kami menunjukkan bahwa dimerisasi Nyx memainkan peran penting dalam fungsinya. Kami tidak dapat pada tahap ini menyimpulkan apakah heterodimer atau heterotetramer terbentuk selama infeksi. Karakterisasi biokimia in situ tambahan perlu dilakukan selama infeksi tetapi kami memerlukan pendekatan yang lebih baik untuk memantau efektor yang ditranslokasi, dalam kondisi asli. Data kami menunjukkan bahwa antarmuka dimer harus berbeda dari antarmuka interaksi NyxA-NyxB. Memang, dalam struktur kristal NyxB, dua dimer berbeda dapat diamati yang kami beri nama dimer 1 dan dimer 2 dalam publikasi asli [ [ 1 ] ]. Sementara penelitian kami sebelumnya dan data yang disajikan di sini dengan jelas menunjukkan bahwa dimer 1 adalah bentuk homodimerik NyxB, ada kemungkinan bahwa dimer 1 NyxA berkumpul dengan dimer 1 NyxB melalui antarmuka kedua yang kami identifikasi sebelumnya [ [ 1 ] ]. Pada sel inang selama infeksi, kedua konformasi ini mungkin relevan, salah satunya memungkinkan dimerisasi dan yang lainnya memungkinkan heterotetramerisasi NyxA-NyxB. Pembentukan heterotetramer Nyx berpotensi meningkatkan efisiensi perekrutan SENP3 atau pembentukan kompleks yang lebih besar dengan target seluler lain yang belum diidentifikasi.
Delokalisasi SENP3 digunakan sebagai ukuran fungsi Nyx selama infeksi. Meskipun konsekuensi dari interaksi ini masih belum jelas, SENP3 penting untuk multiplikasi intraseluler pada tahap akhir siklus Brucella intraseluler . Meskipun mengamati bahwa bentuk monomerik NyxA dan NyxB masih mampu berinteraksi dengan SENP3 secara in vitro dan ketika diekspresikan secara ektopik dalam sel, efisiensi perekrutan SENP3 berkurang secara signifikan. Hal ini kemungkinan menjelaskan hasil pada sel yang terinfeksi di mana hampir tidak ada delokalisasi SENP3 yang diamati. Ada kemungkinan bahwa monomer memiliki interaksi yang berkurang dengan SENP3 yang tidak dapat dideteksi oleh ko-imunopresipitasi. Ada kemungkinan juga bahwa interaksi tambahan terjadi selama infeksi, misalnya, dengan efektor lain, yang terganggu oleh hilangnya keadaan dimerik Nyx. Secara konsisten, penghapusan NyxA dan NyxB tidak cukup untuk kembali ke keadaan tidak terinfeksi dalam hal lokalisasi SENP3 dan tidak memengaruhi perkalian intraseluler seperti yang diamati pada sel yang kekurangan SENP3, yang menunjukkan efektor tambahan mungkin terlibat. Kita tidak dapat mengesampingkan bahwa mutasi monomerik NyxA-L93E dan NyxB-L97E memiliki efek tambahan selain memengaruhi pembentukan dimer, yang akan mengganggu fungsinya dalam sel inang.
Hasil-hasil ini menyoroti pentingnya interaksi molekuler yang terjadi antara efektor Nyx dan bagaimana keadaan dimerisasinya berkontribusi terhadap fungsinya selama infeksi.
