Abstrak
Undecaprenyl phosphate (C55P ) adalah pembawa gula esensial untuk sintesis dinding sel bakteri, yang telah memperoleh kepentingan dalam beberapa tahun terakhir sebagai target yang menjanjikan untuk pengembangan antibiotik baru. Dalam Escherichia coli , C55P diproduksi oleh defosforilasi undecaprenyl diphosphate (C55PP ) oleh BacA dan dua enzim famili fosfatase asam fosfatida tipe 2 (PAP2), PgpB dan YbjG, di ruang periplasma. Untuk memperjelas mekanisme pengaturan defosforilasi C55PP , kami mengukur C55P dan C55PP menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi yang baru, melakukan uji kerentanan terhadap basitrasin, dan menganalisis ekspresi gen bacA , pgpB , dan ybjG dalam strain E. coli dengan gangguan tunggal dan ganda dari gen tersebut. Tingkat C55P serupa di semua galur, tetapi tingkat C55PP hanya meningkat pada galur dengan gangguan ganda bacA, ybjG . Galur dengan gangguan ganda yang mengandung gangguan bacA dan galur dengan gangguan tunggal bacA lebih rentan terhadap basitrasin daripada galur lainnya. Pada galur dengan gangguan ganda yang mengandung gangguan bacA , ekspresi gen pgpB dan ybjG yang tersisa meningkat. Hasil ini menunjukkan bahwa transkripsi gen enzim keluarga PAP2, pgpB dan ybjG , diaktifkan dalam kondisi di mana aktivitas defosforilasi C55PP dalam sel berkurang. Regulasi transkripsi ini mungkin berkontribusi pada pemeliharaan tingkat C55P dalam sel.
Singkatan
C45P
nonaprenil fosfat
C 45 PP
nonaprenil difosfat
C 55 P
undekaprenil fosfat
C 55 PP
undekaprenil difosfat
ECA
antigen umum enterobacterial
GLCNAc (Glukosa)
N -asetil glukosamin
HPLC
kromatografi cair kinerja tinggi
KPB
penyangga kalium fosfat
Bahasa Inggris MurNAc
Asam N -asetil muramat
DARI 600
kepadatan optik pada 600 nm
PAP2
fosfatase asam fosfatida tipe 2
Bahasa Indonesia: UDP
uridin difosfat
Undecaprenyl phosphate (C 55 P) berfungsi sebagai pembawa gula dalam biosintesis polisakarida pembungkus sel bakteri seperti peptidoglikan [ [ 1 ] ], antigen O [ [ 2 ] ], dan antigen umum enterobacterial [ [ 3 ] ] (Gbr. 1A ) dan merupakan molekul penting untuk kelangsungan hidup bakteri [ [ 4 – 6 ] ]. Dalam beberapa tahun terakhir, karena masalah peningkatan resistensi obat pada bakteri menjadi lebih serius, jalur biosintesis C 55 P dianggap sebagai target yang menjanjikan untuk antibiotik baru [ [ 4 , 7 ] ]. Dalam jalur biosintesis C55P , undecaprenyl difosfat (C55PP ) disintesis dalam sitoplasma melalui kondensasi berurutan delapan molekul isopentenyl difosfat dengan farnesyl difosfat melalui kerja sintase C55PP ( IspU/Rth) [ [ 8 , 9 ] ] (Gbr. 1B ). C55P kemudian diproduksi melalui defosforilasi C55PP . Gula uridina difosfat bereaksi berurutan dengan C55P untuk membentuk perantara gula terkait C55PP untuk biosintesis polisakarida [ [ 1 – 3 ] ] . Perantara gula terkait C55PP diangkut ke luar membran sitoplasma oleh flippase spesifik dan menjadi substrat untuk biosintesis polisakarida [ [ 10 , 11 ] ]. C 55 PP dilepaskan ke dalam lapisan periplasma selama sintesis polisakarida [ [ 1 – 3 ] ]. C 55 PP mengalami defosforilasi untuk membentuk C 55 P [ [ 12 ] ], yang kemudian diangkut ke bagian dalam membran sitoplasma [ [ 13 , 14 ] ]. Ini disebut jalur daur ulang untuk sintesis C 55 P [ [ 4 ] ].
Gbr. 1
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Fungsi C55P dalam Escherichia coli . (A) Representasi skematis peran C55P dalam biosintesis peptidoglikan, antigen O, dan antigen umum enterobakteri (ECA). Biosintesis peptidoglikan dimulai oleh aksi enzimatik MraY, sedangkan biosintesis antigen O dan ECA dimulai oleh aksi enzimatik WecA. Setelah setiap reaksi enzimatik multilangkah, senyawa yang dihasilkan diangkut ke luar membran sitoplasma oleh transporter spesifik. Anak panah menunjukkan reaksi enzimatik dan aksi transporter. (B) Fungsi C55P dalam jalur biosintesis peptidoglikan. Garis hitam pendek melambangkan gugus undecaprenyl, P yang dilingkari melambangkan gugus fosfat, huruf kapital “M” yang dikelilingi segi enam melambangkan asam N -asetil muramat (MurNAc), dan huruf kapital “G” yang dikelilingi segi enam melambangkan N -asetil glukosamin (GlcNAc). Di bagian dalam membran sitoplasma, pentapeptida uridin difosfat (UDP)-MurNAc dan UDP-GlcNAc dikondensasikan dengan C55P , reaksi dikatalisis oleh MraY dan MurG, masing-masing, untuk menghasilkan lipid II. Lipid II yang dihasilkan diangkut dari bagian dalam ke bagian luar membran sitoplasma oleh MurJ. Pentapeptida disakarida dimasukkan ke dalam rantai peptidoglikan oleh protein pengikat penisilin. C55PP yang dilepaskan didefosforilasi oleh BacA, PgpB, dan YbjG untuk menghasilkan C55P . C55P diangkut dari luar ke dalam oleh UptA dan kemudian didaur ulang. Dalam sintesis de novo , C55 PP disintesis di dalam sitoplasma. Ada dua kemungkinan untuk sintesis de novo C55 P. Yang pertama adalah defosforilasi C55 PP di sisi sitoplasma oleh fosfatase C55 PP yang tidak teridentifikasi yang bekerja di dalam membran sitoplasma (*). Yang kedua adalah defosforilasi C55 PP oleh enzim BacA atau PAP2 setelah translokasi C55 PP dari dalam ke luar membran sitoplasma (**). Mekanisme yang terakhir memerlukan flippase yang meningkatkan translokasi C55 PP dan C55 P melintasi membran sitoplasma.
Pada banyak bakteri, beberapa enzim terlibat dalam defosforilasi C55 PP di ruang periplasma [ [ 4-6 ] ] (Gbr. 1B ). Secara spesifik, fosfatase C55 PP yang sangat spesifik substrat yang termasuk dalam famili BacA dan beberapa fosfatase lipid yang relatif spesifik substrat rendah yang termasuk dalam famili fosfatase asam fosfatida tipe 2 (PAP2) terlibat dalam langkah ini [ [ 15 , 16 ] ]. Pada Escherichia coli , BacA dan dua fosfatase lipid yang termasuk dalam famili PAP2, PgpB dan YbjG, telah dikonfirmasi terlibat dalam defosforilasi C55 PP [ [ 15 ] ]. Enzim PAP2 lain, LpxT, mentransfer fosfat dari C55 PP ke lipid A in vivo , meskipun enzim ini menunjukkan aktivitas yang menghidrolisis C55 PP in vitro [ [ 17 ] ]. Mutasi delesi tunggal dan ganda dari bacA , pgpB , dan ybjG tidak mempengaruhi laju pertumbuhan, tetapi delesi rangkap tiga dari bacA , pgpB , dan ybjG bersifat mematikan, yang menunjukkan bahwa gen-gen ini memiliki peran yang redundan dalam aktivitas defosforilasi C55 PP periplasma yang esensial [ [ 15 ] ] . Dengan membandingkan aktivitas fosfatase C55 PP dari fraksi membran galur disrupsi bacA dengan galur parental, diketahui bahwa BacA adalah fosfatase C55 PP utama , yang mencakup sekitar 75% dari total aktivitas fosfatase C55 PP [ [ 12 ] ] . Dengan memperkuat gen bacA , E. coli menjadi lebih resisten terhadap antibiotik bacitracin, yang menghambat defosforilasi C 55 PP dengan mengikatnya [ [ 18 , 19 ] ].
BacA [ [ 20 , 21 ] ] dan semua enzim PAP2 [ [ 22 – 24 ] ] terlokalisasi di membran sitoplasma, dengan situs aktifnya terletak di sisi periplasma. Dalam sintesis de novo C 55 P, situs defosforilasi C 55 PP yang disintesis di sisi dalam membran sitoplasma [ [ 8 , 9 ] ] masih belum terpecahkan (Gbr. 1B ). Fosfatase yang bertanggung jawab untuk defosforilasi C 55 PP di dalam membran sitoplasma saat ini tidak diketahui. Sebagai alternatif, C 55 PP dapat diangkut ke sisi periplasma oleh flippase yang tidak diketahui dan kemudian didefosforilasi oleh fosfatase yang terlibat dalam jalur daur ulang, seperti BacA, PgpB, dan YbjG.
Ketersediaan C55P penting untuk pertumbuhan bakteri normal [ [ 25 , 26 ] ]. Karena beberapa fosfatase terlibat dalam defosforilasi C55PP , mungkin ada mekanisme pengaturan untuk aktivitas enzimatiknya. Namun, sejauh mana ketiga fosfatase berkontribusi pada defosforilasi C55PP dalam sel E. coli hidup tidak diketahui, begitu pula mekanisme pengaturannya. Untuk menentukan apakah defosforilasi C55PP merupakan langkah pembatas laju dalam pasokan C55P in vivo , perlu untuk mengukur kadar C55P dan C55PP secara bersamaan dalam sel. Kami telah mengembangkan metode baru untuk mengukur poliprenil fosfat dan poliprenil difosfat dengan mengekstraksinya dari sel dan kemudian menganalisisnya dengan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) [ [ 27 ] ]. Untuk menjelaskan regulasi aktivitas defosforilasi C55 PP , kami menghasilkan galur gen fosfatase E. coli dengan gangguan tunggal dan ganda [ [ 28 ] ] dan mengukur kadar C55P , C55PP , dan total turunan C55P . Selain itu, kami melakukan uji kerentanan terhadap basitrasin sebagai indikator aktivitas defosforilasi C55PP yang berkurang . Akhirnya, kami memeriksa perubahan kadar ekspresi gen terkait sintesis C55P pada galur gangguan gen.
Bahan dan metode
Bahan kimia
Nonaprenil fosfat (C 45 P) dan nonaprenil difosfat (C 45 PP) disintesis dengan fosforilasi nonaprenol komersial (Tokyo Chemical Industry, Tokyo, Jepang) seperti yang dijelaskan sebelumnya [ [ 27 ] ].
Strain bakteri dan kondisi pertumbuhan
Strain bakteri yang digunakan dalam penelitian ini tercantum dalam Tabel 1. Strain JWK1270, JWK3029, dan JWK5112 [ [ 29 ] ], dan plasmid pCP20 [ [ 30 ] ] disediakan oleh National BioResource Project (NIG, Mishima, Shizuoka, Jepang): E. coli . Strain E. coli dengan gangguan gen tunggal dan ganda dibuat melalui transduksi dengan fag P1 dan transformasi dengan pCP20 seperti yang dilaporkan sebelumnya [ [ 28 , 30 ] ]. Gangguan gen dikonfirmasi dengan melakukan PCR koloni (Gbr. 2 ) menggunakan primer yang tercantum dalam Tabel 2. E. coli ditumbuhkan dalam kaldu L (10 g polipepton, 5 g ekstrak ragi, 5 g NaCl, 1 g glukosa, dan 4,25 mmol NaOH dalam 1000 mL H2O ) .
Tabel 1. Strain bakteri.
Gambar 2
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Konstruksi galur pengganggu gen. Analisis PCR koloni kromosom galur pengganggu gen dan galur induk dilakukan dua kali, dan hasil representatif ditunjukkan di sini. Fragmen DNA bacA (A), pgpB (B), dan ybjG (C) diamplifikasi dan dipisahkan dengan elektroforesis dalam gel agarosa 0,85%. Jalur 1, W3110; 2, W3110Δ bacA ; 3, W3110Δ pgpB ; 4, W3110Δ ybjG ; 5, W3110Δ bacA Δ pgpB ; 6, W3110Δ bacA Δ ybjG ; 7, W3110Δ pgpB Δ ybjG ; M, tangga DNA 1 kb.
Tabel 2. Oligonukleotida yang digunakan untuk PCR koloni.
Ekstraksi dan pemurnian poliprenil fosfat dan difosfat dari E. coli
Ekstraksi dan pemurnian poliprenil fosfat dan difosfat dari E. coli dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [ [ 27 ] ]. Sel dikultur dalam kaldu L selama 3 jam dengan pengocokan pada suhu 37 °C. Setelah mengukur kerapatan optik pada 600 nm (OD 600 ) untuk kerapatan sel, sel yang tumbuh dalam 20 mL medium dikumpulkan dan disuspensikan dalam 1 mL buffer kalium fosfat (KPB) 0,1 M (pH 7,4). Kemudian, 2,5 mL metanol dan 1,25 mL kloroform ditambahkan ke suspensi. Sebagai standar internal untuk kuantifikasi C55P dan C55PP , masing-masing, 4,47 μg C45P dan 2,37 μg C45PP ditambahkan ke dalam campuran. Setelah pencampuran selama 2 menit, campuran didiamkan pada suhu ruangan selama 10 menit. Setelah disentrifugasi pada 1500 g selama 10 menit, supernatan dipindahkan ke tabung reaksi alkana perfluoroalkoksi yang baru. Pada supernatan, 1,25 mL kloroform dan 1,25 mL 0,1 m KPB (pH 7,4) ditambahkan lalu diaduk selama 2 menit. Setelah dibiarkan pada suhu ruangan selama 5 menit dan disentrifugasi pada 1500 g selama 5 menit, lapisan kloroform yang lebih rendah dikumpulkan. Ekstrak kloroform dikeringkan di bawah aliran gas nitrogen dan dilarutkan dalam 1 mL kloroform–metanol–air (10 : 10 : 3, v/v/v). Larutan yang dihasilkan diaplikasikan ke kolom yang diisi dengan 0,5 g Supelclean LC-NH 2 SPE (Merck, Darmstadt, Jerman). Setelah dicuci dengan 3 mL kloroform–metanol–air (10 : 10 : 3, v/v/v), 4 mL kloroform–metanol–air (2 : 0,9 : 0,1, v/v/v), dan 4 mL kloroform–metanol–air (2 : 0,9 : 0,1, v/v/v) yang mengandung 0,1 M amonium asetat, poliprenil fosfat dielusi dengan 10 mL kloroform–metanol–air (2 : 0,9 : 0,1, v/v/v) yang mengandung 0,2 M amonium asetat, kemudian poliprenil difosfat dielusi dengan 10 mL kloroform–metanol–air (10 : 10 : 3, v/v/v) yang mengandung 0,4 M amonium asetat. Masing-masing eluen dicuci dengan 1,5 mL 0,1 m KPB (pH 7,4), dan lapisan kloroform diambil sebagai fraksi poliprenil fosfat dan difosfat.
Ekstraksi dan pemurnian poliprenil fosfat setelah hidrolisis alkali
Ekstraksi total turunan poliprenil fosfat dari E. coli dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [ [ 27 ] ]. Sel yang tumbuh dalam 20 mL medium dikumpulkan dan disuspensikan dalam 2 mL metanol. Setelah menambahkan 3,87 μg C45P sebagai standar internal untuk kuantifikasi total turunan C55P , 1 mL KOH 60% ditambahkan ke suspensi dan dipanaskan dalam penangas air mendidih selama 1 jam. Setelah didinginkan hingga suhu kamar, poliprenil fosfat diekstraksi tiga kali dengan 2 mL, 2 mL, dan terakhir 3 mL dietil eter. Ekstrak dietil eter digabungkan dan dicuci dengan 2 mL asam asetat 5%. Poliprenil fosfat dimurnikan dengan kromatografi pertukaran ion seperti yang dijelaskan di atas.
Analisis HPLC poliprenil fosfat dan difosfat
Analisis poliprenil fosfat dan difosfat dengan HPLC dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [ [ 27 ] ]. Fraksi poliprenil fosfat dan difosfat yang dikeringkan di bawah aliran gas nitrogen dilarutkan dalam 300 dan 100 μL tetraetilamonium fosfat berair 25 mm ( pH 7,5)–2-propanol (35 : 65, v/v), masing-masing. Fraksi poliprenil fosfat dianalisis dengan HPLC fase terbalik menggunakan kolom Mightysil RP-18 GP Aqua (5 μm, 150 × 4,6 mm) (Kanto Chemical, Tokyo, Jepang). Fase mobil yang digunakan adalah 2-propanol–metanol (1 : 4, v/v) yang mengandung 5 mm asam fosfat pada laju alir 1,5 mL·min −1 dan suhu kolom diatur pada 40 °C. Fraksi poliprenil difosfat dianalisis dengan HPLC pasangan ion fase terbalik menggunakan kolom Cadenza CD-C18 MF (Imtakt, Kyoto, Jepang). Fase gerak yang digunakan adalah tetraetilamonium fosfat berair 25 m m (pH 7,5)–2-propanol (2 : 3, v/v) pada laju alir 0,15 mL·min −1 dan suhu kolom ditetapkan pada 60 °C. Poliprenil fosfat dan difosfat dideteksi pada absorbansi 210 nm dan C55P dan C55PP diukur dengan rasio luas puncak terhadap standar internal yang sesuai, masing-masing C45P dan C45PP .
Kerentanan terhadap basitrasin
Sel dikultur dalam kaldu L dengan pengocokan pada suhu 37 °C semalaman. Kaldu kultur dinormalisasi menjadi OD 600 = 1, dan pengenceran serial 10 kali lipat dibuat. Lima mikroliter dari setiap pengenceran ditaburkan pada agar kaldu L yang mengandung basitrasin (Toronto Research Chemicals, Vaughan, Ontario, Kanada) pada konsentrasi antara 0,5 dan 2 mg·mL −1 . Plat diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam dan difoto.
Pemurnian RNA dan sintesis cDNA
Sel dikultur dalam kaldu L selama 3 jam pada suhu 37 °C dengan pengocokan. Pada 1 mL RNA Protect Bacterial Agent (Qiagen, Hilden, Jerman), 500 μL kaldu kultur ditambahkan dan dipusarkan selama 5 detik. Setelah didiamkan pada suhu ruangan selama 5 menit, campuran disentrifugasi pada 5000 g selama 10 menit, dan supernatan dibuang. Setelah satu siklus beku-cair pada suhu -80 °C dan 37 °C, pelet disuspensikan kembali dalam 200 μL lisozim 10 mg·mL -1 dalam buffer TE. Campuran diinkubasi dalam blok panas pada suhu 37 °C selama 5 menit dengan pengocokan setiap 2 menit. Demikian pula, setelah satu siklus beku-cair pada suhu -80 °C dan 37 °C, campuran diinkubasi dalam blok panas pada suhu 37 °C selama 10 menit dengan pengadukan setiap 2 menit. Selain itu, campuran mengalami lima siklus beku-cair pada suhu -80 °C dan 37 °C. Ekstraksi total RNA dilakukan menggunakan RNeasy Mini Kit (Qiagen) dengan pencernaan DNase pada kolom yang dilakukan menggunakan RNase-Free DNase Set (Qiagen) sesuai dengan petunjuk pabrik. Pemurnian total RNA dilakukan dalam rangkap tiga untuk setiap galur. Konsentrasi total RNA diukur menggunakan GeneQuant pro (GE Healthcare, Chicago, IL, AS), dan rasio 260/280 dan 260/230 diperiksa untuk mengetahui kontaminasi protein dan pelarut. Transkripsi balik dilakukan pada 500 ng total RNA yang diekstraksi menggunakan ReverTra Ace qPCR RT Master Mix dengan gDNA Remove (Toyobo, Osaka, Jepang) sesuai dengan petunjuk kit.
PCR kuantitatif waktu nyata
PCR real-time dilakukan dengan THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (Toyobo) menggunakan AriaMx (Agilent, Santa Clara, CA, AS). Primer yang digunakan dalam penelitian ini dijelaskan dalam Tabel 3 [ [ 31 , 32 ] ]. Sebelum qPCR, efisiensi amplifikasi primer diuji. Campuran reaksi disiapkan sebagai berikut: 10 μL THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix, 0,6 μL primer Fw 10 μm , 0,6 μL primer Rv 10 μm , 4 μL cDNA, dan 4,8 μL air suling steril dengan total 20 μL. PCR real-time dilakukan pada suhu 95 °C selama 3 menit, diikuti oleh 40 siklus pada suhu 95 °C selama 15 detik dan 60 °C selama 1 menit. Setelah reaksi di atas, analisis kurva leleh dilakukan pada suhu 95 °C selama 30 detik, 65 °C selama 30 detik, dan 95 °C selama 30 detik untuk memastikan tidak ada amplifikasi non-spesifik. Setiap sampel diukur dalam duplikat. cysG dan idnT digunakan sebagai gen referensi [ [ 32 ] ], dan perbandingan ekspresi gen dievaluasi menggunakan metode ΔΔ C t [ [ 33 ] ].
Tabel 3. Primer yang digunakan untuk PCR kuantitatif real-time.
Analisis statistik
Analisis statistik dilakukan dengan ANOVA satu arah menggunakan uji perbandingan berganda Dunnett dalam perangkat lunak ezr [ [ 34 ] ].
Hasil
Kuantifikasi turunan C55P , C55PP , dan total C55P
Kandungan C55P dan C55PP dalam sel E. coli yang tumbuh hingga fase pertumbuhan eksponensial ditentukan dengan menganalisis lipid yang diekstraksi dengan kloroform dan metanol. Ekstrak kloroform–metanol dilewatkan melalui kartrid pertukaran anion untuk memperoleh fraksi poliprenil fosfat dan fraksi poliprenil difosfat, yang kemudian dianalisis dengan HPLC untuk memperoleh kandungan C55P (Gbr. 3A ) dan C55PP ( Gbr. 3B ), masing-masing. Kadar C55P dan C55PP dalam galur tipe liar, W3110, masing-masing adalah 333 ± 31 dan 4,0 ± 0,2 nmol·g −1 berat kering sel (Gbr. 4 ). Total kandungan derivatif C55P , termasuk C55P , C55PP , dan zat antara gula yang terhubung dengan C55P dan C55PP , dalam sel ditentukan dengan menganalisis lipid yang diekstraksi dengan dietil eter setelah perlakuan sel dengan alkali. Karena C55PP dan zat antara gula yang terhubung dengan C55P dan C55PP dihidrolisis menjadi C55P melalui perlakuan alkali, total kandungan C55P , C55PP , dan zat antara gula yang terhubung dengan C55P dan C55PP dapat ditentukan dengan mengukur C55P dalam ekstrak dietil eter setelah perlakuan alkali menggunakan HPLC. Total kadar derivatif C55P dalam W3110 adalah 528 ± 15 nmol·g −1 berat kering sel (Gbr. 4 ). Kadar C55P dan C55PP masing -masing adalah 63% dan 0,8% dari total kadar turunan C55P , yang menunjukkan bahwa jumlah C55PP relatif rendah. Selisih antara total kadar turunan C55P dan jumlah kadar C55P dan C55PP dianggap sebagai total kadar berbagai zat antara gula yang terikat C55P dan yang terikat C55PP , yang mencakup 36% dari total kadar turunan C55P .
Gambar 3
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Analisis HPLC poliprenil fosfat dan poliprenil difosfat dari W3110. Poliprenil fosfat dan poliprenil difosfat diekstraksi dari tiga sampel yang secara biologis independen dari semua galur, dipisahkan dengan kromatografi pertukaran ion, dan dianalisis dengan HPLC. Kromatogram representatif ditunjukkan di sini. (A) Fraksi poliprenil fosfat. Sampel diaplikasikan ke kolom Mightysil RP-18 GP Aqua, dan elusi dilakukan dengan 2-propanol–metanol (1 : 4, v/v) yang mengandung 5 mm asam fosfat. (B) Fraksi poliprenil difosfat. Sampel diaplikasikan ke kolom Cadenza CD-C18 MF, dan elusi dilakukan dengan 25 mm tetraetilamonium fosfat berair (pH 7,5)–2-propanol (30 : 70, v/v).
Gambar 4
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Tingkat C55 PP , C55 P , dan total derivatif C55 P. Tiga sampel yang secara biologis independen dari semua galur dianalisis. C55 P dan C55 PP diekstraksi dan kemudian dianalisis dengan HPLC. Total derivatif C55 P diekstraksi dari sel-sel yang sebelumnya diperlakukan dengan alkali dan kemudian dianalisis dengan HPLC. Data statistik disajikan sebagai rata-rata ± simpangan baku ( n = 3). Batang putih, C55 PP ; batang hitam, C55 P ; batang berarsir, total derivatif C55 P. Signifikansi statistik dengan uji perbandingan berganda Dunnett ditunjukkan (* P < 0,05 dan ** P < 0,01 dibandingkan dengan W3110).
Berikutnya, kami membandingkan kandungan C55P , C55PP , dan total turunan C55P pada galur pengganggu gen. Kadar C55P tidak berbeda secara signifikan dari galur tipe liar pada galur pengganggu gen mana pun. Kadar C55PP adalah 33 ± 3 nmol·g −1 berat kering sel pada galur pengganggu ganda bacA dan ybjG , yang secara signifikan lebih tinggi daripada kadar pada galur tipe liar (8,3 kali lebih tinggi). Pada galur pengganggu gen lainnya, tidak ada perbedaan signifikan pada kadar C55PP dibandingkan dengan galur tipe liar. Total kadar turunan C55P secara signifikan lebih tinggi pada galur pengganggu bacA dan semua galur pengganggu ganda daripada pada galur tipe liar, yaitu sekitar 1,3 kali kadar pada galur tipe liar.
Pengujian kerentanan basitrasin
Bacitracin memberikan efek antibakterinya dengan mengikat C55 PP dan menghambat defosforilasi C55 PP [ [ 19 ] ]. Kami meneliti kerentanan strain pengganggu gen terhadap basitrasin sebagai indikator penurunan aktivitas defosforilasi C55 PP pada strain ini (Gbr. 5 ). Strain pengganggu ganda bacA dan ybjG adalah yang paling rentan terhadap basitrasin. Strain pengganggu bacA dan strain pengganggu ganda bacA , pgpB menunjukkan kerentanan tertinggi berikutnya terhadap basitrasin. Kerentanan terhadap basitrasin dari strain pengganggu pgpB , strain pengganggu ybjG , dan strain pengganggu ganda pgpB , ybjG mirip dengan strain tipe liar.
Gambar 5
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Sensitivitas terhadap basitrasin. Kaldu kultur semalam dinormalisasi menjadi OD 600 = 1, dan pengenceran serial 10 kali lipat disiapkan. Lima mikroliter dari setiap pengenceran diteteskan ke agar kaldu L yang mengandung basitrasin pada konsentrasi berkisar antara 0,5 dan 2 mg·mL −1 . Plat diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam. Tiga percobaan independen dilakukan, dan hasilnya konsisten. Gambar yang ditampilkan merupakan gambaran dari hasil yang diperoleh.
Analisis ekspresi gen yang terlibat dalam sintesis dan defosforilasi C55 PP
Tingkat C55P tidak berubah secara signifikan oleh gangguan gen lipid fosfatase. Untuk menyelidiki apakah ekspresi gen yang terlibat dalam sintesis dan defosforilasi C55 PP diatur, ekspresi gen sintase C55 PP , ispU , dan gen yang terlibat dalam defosforilasi C55 PP , bacA , pgpB , dan ybjG diukur (Gbr. 6 ). Ekspresi ispU pada semua galur yang terganggu mirip dengan galur tipe liar (Gbr. 6A ). Pada galur dengan gangguan tunggal dari gen untuk defosforilasi C55 PP , ekspresi gen yang tersisa mirip dengan galur tipe liar (Gbr. 6B–D ). Pada galur dengan gangguan ganda dari gen untuk defosforilasi C55 PP , ekspresi gen yang tersisa cenderung lebih tinggi daripada galur tipe liar (Gbr. 6B–D ). Ekspresi pgpB pada galur bacA , ybjG yang mengalami gangguan ganda adalah 1,8 kali lebih tinggi daripada galur tipe liar (Gbr. 6C ). Ekspresi ybjG pada galur bacA dan pgpB yang mengalami gangguan ganda adalah 12,7 kali lebih tinggi daripada galur tipe liar (Gbr. 6D ).
Gambar 6
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Analisis transkripsi gen-gen yang terkait dengan sintesis C55P . Transkripsi gen ispU (A), bacA (B), pgpB (C), dan ybjG (D) diukur menggunakan tiga sampel yang secara biologis independen untuk semua galur. Galur tipe liar W3110 dinormalisasi dan dibandingkan dengan galur yang mengalami gangguan gen. Setiap pengukuran qPCR dilakukan secara duplikasi. Data statistik disajikan sebagai rata-rata ± simpangan baku ( n = 3). Signifikansi statistik dengan uji perbandingan berganda Dunnett ditunjukkan (* P < 0,05 dan ** P < 0,01 dibandingkan dengan W3110).
Diskusi
Dalam E. coli , empat enzim, BacA, PgpB, YbjG, dan LpxT, bertanggung jawab untuk defosforilasi C55 PP , yang terlibat dalam penyediaan C55 P [ [ 15 ] ]. Diprediksi bahwa aktivitas defosforilasi C55 PP akan lebih rendah pada galur pengganggu gen dari enzim-enzim ini daripada pada galur tipe liar. Dalam penelitian ini, kami menyelidiki bagaimana mengganggu satu atau dua dari tiga gen, bacA , pgpB , dan ybjG , memengaruhi kadar C55 PP dan C55 P. Kadar C55 PP , substrat, pada galur pengganggu gen tunggal mirip dengan yang ada pada galur tipe liar. Di antara galur pengganggu ganda, hanya kadar C55 PP pada galur pengganggu ganda bacA , ybjG yang secara signifikan lebih tinggi daripada yang ada pada galur tipe liar yaitu 8,3 kali. Kadar C55P , produk reaksi enzim, serupa pada semua galur. Ditemukan bahwa aktivitas enzim yang tersisa pada galur pengganggu gen cukup untuk menyediakan C55P pada tingkat yang sama dengan galur tipe liar.
Meningkatnya kerentanan terhadap basitrasin dianggap sebagai indikator menurunnya aktivitas defosforilasi C55 PP intraseluler [ [ 15 ] ] . Fakta bahwa kerentanan basitrasin dari galur pengganggu bacA dan galur pengganggu ganda yang mengandung gangguan bacA lebih tinggi daripada galur tipe liar dan galur pengganggu lainnya menunjukkan bahwa aktivitas BacA lebih tinggi daripada aktivitas total dari dua enzim lainnya, PgpB dan YbjG. Ini konsisten dengan laporan oleh El Ghachi et al . [ [ 12 ] ], yang melaporkan bahwa sekitar 75% dari aktivitas defosforilasi C55 PP yang diukur secara in vitro disebabkan oleh aktivitas BacA. Galur pengganggu ganda bacA dan ybjG menunjukkan kerentanan tertinggi terhadap basitrasin di antara galur pengganggu bacA , yang menunjukkan bahwa ia memiliki aktivitas defosforilasi C55 PP terendah . Hal ini konsisten dengan hasil bahwa tingkat C 55 PP tertinggi pada strain gangguan ganda bacA dan ybjG .
Pada galur-galur dengan gangguan gen, tingkat penurunan aktivitas defosforilasi C55 PP harus dikurangi karena tingkat ekspresi gen yang tersisa untuk defosforilasi C55 PP meningkat. Pada semua galur dengan gangguan ganda, terdapat kecenderungan peningkatan ekspresi gen tunggal yang tersisa dibandingkan dengan galur tipe liar. Meskipun tidak terdapat perbedaan signifikan dalam ekspresi bacA pada galur dengan gangguan ganda pgpB , ybjG dibandingkan dengan galur tipe liar, ekspresi ybjG dan pgpB pada galur dengan gangguan ganda bacA dan pgpB , dan bacA dan ybjG masing-masing adalah 12,7 dan 1,8 kali lipat dari galur tipe liar, dan perbedaan signifikan telah diamati. Peningkatan ekspresi gen pada galur dengan gangguan ganda dianggap berkontribusi pada pemeliharaan tingkat C55P melalui peningkatan aktivitas defosforilasi C55 PP intraseluler .
Tingkat total derivatif C55P pada galur dengan gangguan bacA dan galur dengan gangguan ganda pgpB dan ybjG secara signifikan lebih tinggi daripada yang ada pada galur tipe liar, meskipun perbedaannya kecil. Galur dengan gangguan bacA dan galur dengan gangguan ganda pgpB dan ybjG diperkirakan memiliki penurunan yang signifikan dalam aktivitas defosforilasi C55 PP intraseluler . Ada kemungkinan bahwa sintesis C55 PP ditingkatkan untuk mempertahankan tingkat C55P pada galur ini. Meskipun tidak ada perbedaan dalam ekspresi gen undecaprenyl diphosphate synthase, ispU , antara galur yang diuji, ada kemungkinan bahwa tahapan biosintesis C55 PP lebih jauh ke hulu, seperti jalur metileritritol fosfat dari sintesis isopentenil difosfat [ [ 35 ] ], diatur.
Kami menemukan bahwa tingkat C55P tetap konstan di semua galur, sementara ekspresi gen lipid fosfatase, pgpB dan ybjG , dan tingkat total derivatif C55P meningkat di beberapa galur dengan gangguan gen. Telah diusulkan bahwa kontrol tingkat C55P penting untuk pertumbuhan bakteri normal dari studi galur mutan yang mengakumulasi perantara gula terkait C55 PP yang diproduksi selama biosintesis eksopolisakarida [ [ 25 , 26 ] ]. Diperkirakan bahwa aktivasi transkripsi gen enzim PAP2 dan peningkatan biosintesis isoprenoid pada galur yang mengalami gangguan gen berkontribusi pada pemeliharaan tingkat C55P pada galur ini.
Akhirnya, apa mekanisme yang mendasari regulasi ini? Pertama, respons langsung terhadap penurunan aktivitas defosforilasi C55 PP dapat dipertimbangkan. Baru-baru ini, Roney et al. telah menunjukkan bahwa ekspresi gen yang terlibat dalam pasokan C55P di Bacillus subtilis berada di bawah kendali faktor transkripsi SigM, dan mereka telah mengusulkan bahwa kekurangan C55P adalah sinyal langsung untuk mengaktifkan SigM [ [ 36 ] ]. Di sisi lain, telah dilaporkan bahwa substrat C55PP menghambat protein pengikat penisilin PBP1B, yang terlibat dalam biosintesis peptidoglikan, dan diperkirakan bahwa akumulasi C55PP merugikan [ [ 37 ] ]. Akan masuk akal untuk berasumsi bahwa ekspresi gen untuk defosforilasi C55PP diatur menurut tingkat C55P atau C55PP , tetapi sulit untuk mengatakan mana yang terjadi berdasarkan hasil penelitian ini. Pada galur pengganggu gen, tingkat total derivatif C55P meningkat, yang menunjukkan peningkatan tingkat perantara gula yang terhubung dengan C55P dan C55PP . Baru -baru ini, telah dilaporkan contoh-contoh di mana akumulasi perantara gula yang terhubung dengan C55PP berfungsi sebagai sinyal pengaturan umpan balik [ [ 38 ] ]. Meskipun hubungan kausal langsung antara penurunan aktivitas defosforilasi C55PP dan akumulasi perantara gula yang terhubung dengan C55P atau C55PP sulit untuk ditetapkan, ada kemungkinan bahwa beberapa perantara gula yang terhubung dengan C55P dan C55PP bertindak sebagai sinyal pengaturan. Identifikasi zat yang bertindak sebagai sinyal pengaturan masih menjadi tantangan di masa depan.
